Die konvergente somatische Evolution beginnt in utero in einer Keimbahn-Ribosomopathie

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 5092 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die klonale Verfolgung von Zellen mithilfe somatischer Mutationen ermöglicht die Erforschung der klonalen Dynamik bei Erkrankungen des Menschen. Hier führen wir eine Sequenzierung des gesamten Genoms von 323 hämatopoetischen Kolonien von 10 Personen mit der vererbten Ribosomopathie Shwachman-Diamond-Syndrom durch, um die hämatopoetische Phylogenie zu rekonstruieren. In etwa 30 % der Kolonien identifizieren wir sich gegenseitig ausschließende Mutationen in TP53, EIF6, RPL5, RPL22, PRPF8 sowie Chromosom 7- und 15-Aberrationen, die die SBDS- bzw. EFL1-Gendosis erhöhen. Zielgenmutationen beginnen in der Gebärmutter und führen zu einer Vielzahl klonaler Erweiterungen, wobei nur wenige hämatopoetische Stammzelllinien (Mittelwert 8, Bereich 1–24) etwa 50 % der hämatopoetischen Kolonien bei 8 Individuen ausmachen (Bereich 4–100 % Klonalität). bis zum jungen Erwachsenenalter. Eine schnelle klonale Expansion während der Krankheitstransformation ist mit biallelischen TP53-Mutationen und einer erhöhten Mutationslast verbunden. Unsere Studie zeigt, wie eine konvergente somatische Mutation des p53-abhängigen nukleolären Überwachungswegs die schädlichen Auswirkungen der Keimbahn-Ribosomopathie ausgleicht, aber die Möglichkeit für die Entwicklung von TP53-mutiertem Krebs erhöht.

Alle Zellen erwerben im Laufe der Zeit durch eine Reihe exogener und endogener DNA-schädigender Prozesse somatische Mutationen. Die Verfolgung solcher Mutationen hat die Rekonstruktion der Abstammungsgeschichte einzelner hämatopoetischer Stammzellen (HSC) ermöglicht, um die klonale Dynamik bei gesunder und bösartiger menschlicher Hämatopoese über das Leben hinweg darzustellen1,2,3,4. Diese Studien haben gezeigt, dass einige HSCs einen Fitnessvorteil gegenüber anderen erlangen, typischerweise durch den Erwerb bestimmter somatischer Mutationen, was zu einer langsamen, aber kontinuierlichen klonalen Expansion über ein Leben hinweg führt3. Im 7. bis 8. Lebensjahrzehnt kommt es zu einem Zusammenbruch der HSC-Klonvielfalt im Blut mit vielen klonalen Erweiterungen, die durch Mutationen in einer Reihe von Genen (z. B. DNMT3A) und Änderungen der Kopienzahl (z. B. Verlust von Y) verursacht werden3,5,6 . Es ist jedoch relativ wenig darüber bekannt, wie sich die Klonselektion und die Populationsdynamik bei Personen unterscheiden, die mit Keimbahnmutationen geboren wurden, die die Hämatopoese beeinträchtigen und ein erhöhtes Blutkrebsrisiko mit sich bringen.

Das Shwachman-Diamond-Syndrom (SDS) ist eine vererbte Ribosomen-Assemblierungsstörung, die durch zusammengesetzte heterozygote Keimbahnmutationen im SBDS-Gen verursacht wird, typischerweise die Kombination eines Null- und eines hypomorphen Allels7,8,9. Das Wildtyp-SBDS-Protein kooperiert mit der GTPase EFL1, um die Freisetzung des Anti-Assoziationsfaktors eIF6 von der Intersubunit-Seite der großen ribosomalen Untereinheit zu katalysieren und so die Reifung und das Recycling der Ribosomen zu fördern8,9,10,11,12. Der daraus resultierende Defekt des Ribosomenaufbaus und die verminderte Proteinsynthese führen zu Knochenmarkversagen (BMF), wobei mehr als ein Drittel der Personen im vierten Lebensjahrzehnt eine Myelodysplasie (MDS) und eine akute myeloische Leukämie (AML) entwickeln13,14.

A number of recurrent somatic genetic events have been identified in SDS. In individuals with one null and one hypomorphic SBDS allele on chromosome (chr) 7q, copy number neutral loss of heterozygosity (LOH) increases the gene dose of the hypomorphic SBDS allele c.258 + 2T → C and replaces the null allele15,c mutation of the SBDS gene does not promote development of myeloid malignancies in patients with Shwachman syndrome. Leukemia 23, 708–711 (2009)." href="/articles/s41467-023-40896-5#ref-CR16" id="ref-link-section-d1812976e930"> 16. In ähnlicher Weise kann eine uniparentale Disomie bei chr15 auftreten, um die schädlicheren heterozygoten EFL1-Mutationskombinationen in SDS17 abzuschwächen. Chr20q-Deletion und EIF6-Punktmutationen reduzieren auch die eIF6-Dosierung und/oder ihre Affinität zum Ribosom14,18,19,20,21. Jedes dieser genetischen Ereignisse kompensiert wahrscheinlich die fehlerhafte SBDS-Funktion bei SDS, indem es die Ribosomenhomöostase wiederherstellt.

Eine beeinträchtigte Ribosomenassemblierung stabilisiert das Tumorsuppressorprotein p53 über den nukleolären Überwachungsweg (NSP)22. Eine erhöhte p53-Expression wird in hämatopoetischen Zellen von Personen mit SDS23 beobachtet und eine gezielte Störung von Sbds in Mausmodellen führt zu einer p53-abhängigen Induktion von Apoptose in hämatopoetischen Vorläuferzellen24,25. Tatsächlich kommen TP53-Mutationen bei und innerhalb von Personen mit SDS18,26 immer wieder vor. Da TP53 das am häufigsten veränderte Gen in menschlichen Tumoren ist27, wobei Mutationen sowohl früh in der Tumorentstehung, wie z. B. bei Glioblastomen und Eierstockkrebs28,29,30, als auch spät während der Krebsprogression28,31 auftreten, ist es wichtig, die Auswirkungen zu verstehen TP53-Mutationen auf zelluläre Konkurrenz. SDS bietet einen einzigartigen Einblick in das Verständnis der frühesten Stadien der TP53-mutierten klonalen Selektion aufgrund des Selektionsdrucks, der durch die Keimbahn-SBDS-Mutation ausgeübt wird.

In dieser Studie verwenden wir die Gesamtgenomsequenzierung (WGS) von aus einzelnen Zellen stammenden hämatopoetischen Kolonien, um die Mutationsfolgen, die Selektionslandschaft und die klonale Dynamik bei der Keimbahn-Ribosomopathie (SDS) zu untersuchen. Wir zeigen, dass TP53 und der p53-abhängige nukleoläre Stressweg ein häufiges Ziel sich gegenseitig ausschließender, konvergenter somatischer Mutationen im frühen Leben, auch in der Gebärmutter, sind. Diese Mutationen führen zu einem frühen Verlust der klonalen Diversität, der zwar die schädlichen Auswirkungen einer fehlerhaften Ribosomenanordnung ausgleicht, aber die Wahrscheinlichkeit für die Entwicklung von TP53-mutiertem Krebs erhöht.

Wir untersuchten zehn Personen mit SDS im Alter von 4 bis 33 Jahren, die biallelische Keimbahn-Funktionsverlustmutationen im SBDS-Gen aufwiesen. Wir isolierten einzelne hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) und mononukleäre Zellen (MNCs) aus peripherem Blut oder Knochenmark von Individuen und verwendeten nach der Sequenzierung des gesamten Genoms von aus Einzelzellen stammenden Kolonien (n = 323) die somatischen Mutationen zur Rekonstruktion hämatopoetischer Phylogenien unter Verwendung veröffentlichter Methoden4 (Abb. 1a, b). Die einzelnen Personen wiesen typische klinische Merkmale von SDS auf, darunter Neutropenie, Pankreasinsuffizienz und Osteopenie, und äußerten sich schon früh im Leben in Gedeihstörungen. Die Histomorphologie ergab Hypozellularität des Knochenmarks (Bereich 10–40 %), Dyserythropoese und verminderte Granulopoese mit einem umgekehrten Myeloid-Erythroid-Verhältnis (1:3–4). Bei einer Person (SDS8) entwickelte sich kurz vor der Probenahme ein MDS mit Trilineage-Dysplasie. Die durchflusszytometrische Phänotypisierung von mononukleären Zellen aus Knochenmark (BM) und peripherem Blut (PB) zeigte eine verringerte Häufigkeit der gesamten CD34+-Vorläufer bei Personen mit SDS (Median 0,2 %) im Vergleich zu gesunden Knochenmarkspendern (Median 7,5 %) (t-Test p = 0,01; Abb. 1c und ergänzende Abb. 1), im Einklang mit früheren Studien32. Wir führten bei allen Individuen eine WGS von 323 einzelnen Einzelzellkolonien durch, die aus hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) ausgesät wurden, bis zu einer mittleren Tiefe von 20-fachen Messwerten, zusammen mit passender Wangenabstrich-DNA als Keimbahnreferenz. Somatische Mutationen zusammen mit embryonalen Varianten wurden durch eine Kombination von Mutationsaufrufen unter Verwendung einer passenden Keimbahnreferenz sowie eines nicht übereinstimmenden Variantenaufruf-Ansatzes identifiziert, wie in den Methoden beschrieben. Hämatopoetische Kolonien wurden klonal mit einer mittleren Varianten-Allel-Fraktion (VAF) der somatischen Mutation von > 0,4 ​​abgeleitet und stellten somit die somatischen Mutationen dar, die in der einzelnen Zelle vorhanden waren, die die Kolonie ausgesät hatte. Insgesamt identifizierten wir in der gesamten Kohorte 118.564 Einzelnukleotidvarianten, 6287 kleine Insertionen und Deletionen, 74 Strukturvarianten und 5 Aberrationen der chromosomalen Kopienzahl (Ergänzungsdatensatz 1). Die Anzahl der SNVs pro Kolonie und Individuum reichte von einem Median von 130 (Bereich 99–163) bei den jüngsten (Alter 4 Jahre) bis zu einem Median von 714 (Bereich 593–744) bei einem der älteren Individuen (Alter 25 Jahre). mit MDS (SDS8).

ein Schema des experimentellen Designs. Einzelne hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) und mononukleäre Zellen (MNCs) aus peripherem Blut oder Knochenmark von Personen mit SDS wurden in vitro zu Kolonien expandiert und jede Kolonie wurde einer Gesamtgenomsequenzierung (WGS) unterzogen. Somatische Mutationen wurden verwendet, um hämatopoetische Phylogenien zu rekonstruieren. Der Zeitpunkt der Akquisition, die klonale Dynamik und die funktionellen Konsequenzen wurden für Treibermutationen im Zusammenhang mit SDS untersucht. Inkscape. b Alter bei der Probenahme und SBDS-Genotyp für jede Person mit SDS. Die beiden zweifarbigen Spalten stellen die beiden Elternallele dar, wobei alle Individuen biallelische Keimbahnmutationen in SBDS aufweisen. Hervorgehobene Proben (SDS2, SDS7, SDS9 und SDS10) wurden auf die Häufigkeit von CD34+-HSPCs gemessen, siehe (c). N die Anzahl der pro Person analysierten hämatopoetischen Kolonien. c Die Häufigkeit von CD34+ HSPCs in Knochenmarksproben (ausgedrückt als % aller lebensfähigen MNCs) wurde mittels Durchflusszytometrie bei vier der Personen mit SDS und drei gesunden Personen (schwarz) analysiert. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Somatische Mutationen einzelner Kolonien wurden verwendet, um phylogenetische Bäume der Hämatopoese zu rekonstruieren (Abb. 2). Wir haben bei 7 von 10 Individuen (SDS2, SDS4, SDS5, SDS6, SDS7, SDS8 und SDS10) eine Fülle von klonalen Expansionen festgestellt, eine Beobachtung, die für eine gesunde Hämatopoese bei Personen unter 70 Jahren oder bei Personen mit Blutkrebs, die bisher untersucht wurden, höchst untypisch ist1 ,3,4. Angesichts der Tatsache, dass Blutzellen bei der Geburt typischerweise bereits etwa 50–65 somatische Mutationen erworben haben3, definierten wir postembryonale klonale Expansionen als jede Klade mit ≥2 Kolonien, deren gemeinsamer Vorfahre nach 75 Mutationen ab Beginn der Stammbäume beobachtet wurde. Wir haben 18 solcher klonaler Erweiterungen unterschiedlicher Größe in den Bäumen identifiziert, die 21 % der Kolonien ausmachen (ergänzende Abbildung 2 und ergänzender Datensatz 2).

Phylogenetische Bäume hämatopoetischer Kolonien für zehn Individuen mit SDS. Von jedem Individuum wurden zwischen 10 und 100 Kolonien sequenziert und für die phylogenetische Analyse einbezogen. Zweige mit somatischen Mutationen in Treibergenen, über die zuvor berichtet wurde und/oder die in dieser Studie positiv selektiert wurden, sind farbig. Zweige mit bekannten Treibermutationen der klonalen Hämatopoese werden in Schwarz dargestellt, Zweige, die mit SDS assoziiert sind, in anderen Farben. Der Zweig, der die Treibermutation beherbergt, wird durch eine dickere farbige Linie dargestellt. Die Y-Achse zeigt die Gesamtzahl der somatischen Mutationen einschließlich der Treibermutationen. Reihen unter phylogenetischen Bäumen zeigen die spezifischen Treibermutationen, wobei Kolonien, die diese Mutation beherbergen, dichter gefärbt sind. Bemerkenswert ist, dass unter den in SDS1 und SDS3 gefundenen somatischen Mutationen keine bekannten Treibermutationen festgestellt wurden. *1 Monat vor der Probenahme wurde bei SDS8 eine Transformation in eine Myelodysplasie mit Triliniendysplasie diagnostiziert. Alle SDS8-Kolonien hatten einen komplexen Karyotyp mit vielen chromosomalen (Chr) Kopienzahl-Aberrationen (CNA). CNAs, die sicher von allen SDS8-Kolonien gemeinsam genutzt werden, werden im Baum angezeigt.

Die angeborene Ribosomopathie SDS übt einen starken selektiven Druck für die Expansion von HSCs aus, die fitnesssteigernde somatische Mutationen angesammelt haben14,15,17,18,19,20,21,26. Wir beobachteten mehrere genomische Ereignisse, die direkt auf SBDS abzielen, und identifizierten vier Instanzen von chr7q LOH, die jeweils zu einer zusätzlichen Kopie des hypomorphen SBDS-Allels der Donor-Spleißstellenmutante c.258 + 2T > C führten (SDS5, 4, 7, Abb. 2). und eine somatisch erworbene nicht-synonyme SBDS-Mutation, die ebenfalls auf dem hypomorphen Allel auftritt (SDS10, Abb. 2). Wir haben auch ein chr15-Ereignis (15q24-26 tetra) identifiziert, das die Kopienzahl des EFL1-Gens bei 15q25.2 verdoppelt. Diese somatischen Ereignisse scheinen den Keimbahndefekt direkt zu kompensieren, der die für die Ribosomenreifung erforderliche Zusammenarbeit zwischen SBDS und EFL1 beeinträchtigt8.

Häufiger beobachteten wir häufige und unabhängig voneinander erworbene somatische Mutationen, die fünf weitere Gene betrafen. Es wurde berichtet, dass drei dieser Gene in SDS wiederholt mutiert sind (PRPF8, TP53, EIF6)18,21,26. Darüber hinaus identifizierten wir somatische nicht-synonyme Mutationen unter positiver Selektion in den RPL5- und RPL22-Genen (Verhältnis von normalisierten nicht-synonymen (dN) zu normalisierten synonymen Mutationen (dS) dN:dS >1, q <0,01) (Abb. 2 und 3a). Beide kodieren Proteinkomponenten der großen ribosomalen Untereinheit. Insgesamt identifizierten wir 24 unabhängige Missense-Mutationen in TP53 (ergänzende Abbildung 3), dem mit Abstand am häufigsten mutierten Gen in der Kohorte, sowie 1 Startcodonverlust, 4 Missense-, 2 Nonsense-, 1 Frameshift-Mutation und 5 Gendeletionen in EIF6. Die somatischen Mutationen in RPL22 deuteten auf einen Funktionsverlust hin (1 Startcodonverlust, 1 Nonsense, 2 Spleißstellen, 1 Missense und 2 In-Frame-Deletionen), während es sich bei den RPL5- und PRPF8-Mutationen um Missense-SNVs handelte (n = 4 bzw. 2). Mutationen in den Genen TP53, EIF6, RPL5 und RPL22 traten innerhalb desselben Individuums immer wieder auf, wobei 9 verschiedene TP53-Mutationen in SDS5 und 5 unabhängige EIF6-Mutationen in SDS7 beobachtet wurden (Abb. 2). Zusätzlich zu wiederkehrenden Mutationen in PRPF8, TP53, EIF6, RPL5 und RPL22 beobachteten wir Mutationen in DNMT3A, ASXL1, TET2 und RUNX1, die mit der klonalen Hämatopoese (CH) assoziiert sind, was mit der Studie von Kennedy et al.18 übereinstimmt. Wir bezeichnen wiederkehrende Mutationen in SDS-assoziierten oder bekannten Genen von CH33,34/hämatologischen Krebsarten35 als Treibermutationen (siehe „Methoden“). Von allen Individuen in dieser Studie, die ein Durchschnittsalter von nur 18 Jahren (4–33 Jahre) hatten, wiesen 31 % der Kolonien (101/323) eine Treibermutation auf (Abb. 2 und ergänzende Abb. 2).

a Anzahl nicht-synonymer Mutationen in den vier Genen unter signifikanter positiver Selektion (Verhältnis normalisierter nicht-synonymer Mutationen (dN) zu normalisierten synonymen Mutationen (dS) dN:dS > 1, q < 0,01). b Anteil der Zellen pro Person, die Treibermutationen tragen, klassifiziert nach Gen und Chromosomenanomalie. CH-Gene, die mit der klonalen Hämatopoese und der Veränderung der CNA-Kopienzahl assoziiert sind. c Zeitpunkt der Teilung des jüngsten gemeinsamen Vorfahren (MRCA) klonaler Erweiterungen (Klade bestehend aus 2 oder mehr Kolonien), die Treibermutationen beherbergen. Dies gibt den spätesten Zeitpunkt (zusammen mit dem 95 %-Glaubwürdigkeitsintervall) an, zu dem die Treibermutation erworben wurde, dargestellt durch den abgeleiteten Zeitpunkt des Endes des gemeinsamen Zweigs. Es ist jedoch möglich, dass die Treibermutation zu irgendeinem Zeitpunkt entlang des Zweigs aufgetreten ist das die Treibermutation enthält. Das obere Feld zeigt die zeitliche Vielfalt innerhalb einer einzelnen Person (SDS5) und das untere Feld zeigt das Timing aller identifizierten treiberbasierten Erweiterungen in der gesamten Kohorte (einschließlich SDS5) mit Ausnahme von SDS8. Insgesamt 14 Zweige, die Treibermutationen aus der Kohorte beherbergen, sind auf ihr spätestes Erwerbsalter eingestellt. Die Balken umfassen das 95 %-Glaubwürdigkeitsintervall der MRCAs. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Sowohl die Häufigkeit der Treibermutationen als auch der Grad der klonalen Expansion zwischen den einzelnen Individuen waren heterogen. In 67 von 68 hämatopoetischen Kolonien von drei Individuen (SDS1, SDS3 und SDS9) wurden keine Treibermutationen identifiziert. Im Gegensatz dazu wiesen 46 % der verbleibenden 255 Kolonien von 7 Individuen Treibermutationen auf (Median 48 %, Bereich: 26–100 %; Abb. 2 und 3b). Den drei Individuen mit einer geringen Anzahl an Treibermutationen fehlten auch nachweisbare klonale Erweiterungen (SDS1, SDS3 und SDS9). Wir konnten keine Korrelation zwischen der Prävalenz klonaler Expansionen oder Treibermutationen und Zytopenien im peripheren Blutbild beobachten (Ergänzungstabelle 1).

Wir untersuchten klonale Erweiterungen ohne Treibermutationen sowie nicht erweiterte Zweige für somatische Mutationen in weiteren mutmaßlichen Zielgenen. Wir beobachteten eine große embryonale klonale Expansion in SDS5, die 21 Kolonien umfasste, die eine chromosomale Translokation aufwiesen, die GPR137B beeinflusste und für ein mTORC1-Regulationsprotein kodierte. Nicht-synonyme somatische Varianten wurden auch in Genen identifiziert, die an der Translation (EIF4A1 und EIF5AL1), dem RNA-Metabolismus (DDX23, DDX42, DDX60 und DDX39B) und ribosomalen Proteinen (RPS14 und RPS21) beteiligt sind (Ergänzungsdatensatz 1). Da diese Mutationen nur in einzelnen Kolonien beobachtet wurden, bleibt ihre mögliche Pathogenität unklar.

Abgesehen von einem Individuum (SDS8) mit klonaler Evolution zu biallelischen TP53-Mutationen und MDS-Transformation und einem Individuum (SDS5) mit einer gleichzeitigen TET2-Mutation innerhalb einer TP53-mutierten Gruppe haben wir keine Fälle beobachtet, in denen mehr als eine Treibermutation vorhanden war innerhalb derselben Abstammungslinie (Abb. 2). Kolonien, die Änderungen der Kopienzahl aufwiesen, die die SBDS- oder EFL1-Dosierung (SDS2, SDS4, SDS5 und SDS7) kompensierten, schlossen sich auch gegenseitig mit Kolonien aus, die Nukleotidsubstitutionen in Treibergenen enthielten. Dies legt nahe, dass eine einzelne heterozygote Mutation in einem von mehreren Zielgenen ausreicht, um einen Fitnessvorteil im Zusammenhang mit dem Defekt der Keimbahn-Ribosomenassemblierung zu erzielen.

Insgesamt befanden sich 131 von 323 Kolonien (41 %) entweder in einer erweiterten Abstammungslinie und/oder wiesen eine Treibermutation auf (Median aller Individuen 37 %, Bereich 0–100 %; ergänzende Abbildung 2). Mit Ausnahme der beiden jungen Individuen ohne klonale Erweiterungen oder Treibermutationen (SDS1 und 3) wiesen im Median etwa 50 % der hämatopoetischen Kolonien bei Individuen eine Treibermutation auf oder waren Teil erweiterter Abstammungslinien (Bereich 4–100 %). Unter der Annahme, dass einzelne Kolonien mit Treibermutationen auch kleine klonale Erweiterungen darstellen, produzierten im Durchschnitt 8 erweiterte HSC-Linien (Bereich 1–24 HSC-Linienerweiterungen bei 8 Individuen) die Hälfte der bei diesen Individuen untersuchten hämatopoetischen Zellen. Die Oligoklonalität bei jungen Personen mit SDS steht in krassem Gegensatz zur Hämatopoese bei gesunden/nicht an SDS erkrankten Menschen, bei der ein solches Ausmaß an klonaler Expansion erst nach dem 70. Lebensjahr beobachtet wird3.

Aufgrund des linearen Erwerbs somatischer Mutationen über die Zeit können wir die phylogenetischen Bäume verwenden, um abzuschätzen, wann durch Treibermutationen angetriebene klonale Expansionen im Leben begannen. Dies ist möglich, indem die Anzahl der somatischen Mutationen, die der jüngste gemeinsame Vorfahre einer klonalen Expansion erworben hat, die eine Treibermutation gemeinsam hat, in das chronologische Alter umgerechnet wird (siehe Methoden). Wir haben den Beginn von 14 verschiedenen klonalen Expansionen zeitlich festgelegt, die durch Mutationen in TP53, RPL5, RPL22, PRPF8, EIF6 sowie durch Ereignisse der Kopienzahl, die SBDS und EIF6 beeinflussen, verursacht wurden (Abb. 3c). Sie weisen im Laufe des Lebens eine Reihe klonaler Expansionszeiten auf, beginnend in der frühen Gebärmutter bis zum Alter von 12 Jahren. Mit Ausnahme der Kopienzahlereignisse, die SBDS und EFL1 auf den Chromosomen 7 und 15 betreffen, die beide offenbar in sehr kurzer Zeit in der Gebärmutter aufgetreten sind Bei frühen klonalen Expansionen war der Zeitpunkt der Expansionen unabhängig von den verschiedenen Zielen wie TP53, RPL5, RPL22, PRPF8 und EIF6 (Abb. 3c). Wir stellen jedoch fest, dass unsere Studie aufgrund der längeren Dauer der klonalen Expansion auf die Erkennung früherer Übernahmen somatischer Treibermutationen ausgerichtet ist. Es ist daher plausibel, dass somatische Treibermutationen und klonale Expansionen über die Kindheit hinaus andauern, von unserer Stichprobe jedoch nicht erfasst werden.

Innerhalb der Kohorte wurde bei einer Person (SDS8) im Alter von 25 Jahren MDS diagnostiziert, nachdem sich eine Panzytopenie mit morphologischer Triliniendysplasie und erhöhtem Knochenmarksretikulin entwickelt hatte. Die molekulare Karyotypisierung ergab biallelische TP53-Mutationen mit einem komplexen Karyotyp. Der phylogenetische Baum dieses Individuums, der <1 Monat nach der Diagnose von MDS aus Blut rekonstruiert wurde, bestätigte eine große klonale Expansion, die das myeloische hämatopoetische Kompartiment dominierte, wobei einzelne Kolonien gleichzeitig TP53 I254F- und R248Q-Mutationen enthielten. Biallelische TP53-mutierte Kolonien enthielten auch eine Fülle von CNAs, einschließlich chr5-, 6p-, 11+, 18-, 20- und X- (Abb. 2 und 4d), von denen viele auch durch klinische Karyotypisierung bestätigt wurden. Diese CNAs wurden bei anderen Individuen oder Genotypen nicht beobachtet, einschließlich heterozygoter/monoallelischer TP53-mutierter Kolonien (Abb. 4d), sind aber ein bekanntes Merkmal der Transformation zu MDS/AML in SDS36 und stimmen mit den CNAs überein Es wurde erkannt, dass sie allgemeiner mit biallelischen TP53-Mutantenklonen bei Krebs assoziiert sind37,38.

a Mutationslast (Anzahl SNVs) als Funktion des Alters für zehn Personen mit SDS. Jeder Kreis stellt das Genom einer Kolonie dar, wobei die schwarzen horizontalen Balken die mittlere Belastung pro Individuum darstellen. Es werden zwei Zeitpunkte aus SDS5 in unterschiedlichem Alter angezeigt. Zum Vergleich werden schwarz gefärbte Kreise (normal) angezeigt, die die Mutationslasten von drei hämatopoetisch gesunden (nicht SDS) Personen (veröffentlichte Daten3) darstellen. Die blaue Linie stellt die Regressionslinie durch die Kolonien von Individuen mit SDS dar. b Trinukleotid-Kontext somatischer Mutationen. Die beiden Mutationssignaturen wurden in allen Genomen identifiziert. SBS142, 43 ist durch eine spontane Desaminierung von Cytosinen gekennzeichnet, und die zweite Mutationssignatur, SBSBlood1, 2, 41 genannt, stellt Mutationen dar, die typisch für endogene Mutationen in HSCs sind. c Anzahl der SNVs, die den Mutationssignaturen SBS1 (grün) und SBSblood (blau) in jeder Kolonie von jedem Individuum mit SDS zuzuordnen sind. Jeder Balken repräsentiert das Genom einer Kolonie. Beachten Sie, dass SDS8 aufgrund der erhöhten SBS1-Mutationen eine höhere Gesamtmutationslast aufweist. d Variation der Kopienzahl für zwei repräsentative Koloniegenome mit heterozygoter/monoallelischer TP53-Mutation (von verschiedenen Individuen) und zwei klonal verwandte Kolonien aus SDS8 mit biallelischen TP53-Mutationen. Für die beiden Elternallele (grün und rot) wird auf der Y-Achse die Ploidie und auf der X-Achse die Genomposition angezeigt. Aberration der CNA-Kopienzahl. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Mutationslast in SDS8-Kolonien war deutlich höher als für das Alter dieser Person erwartet. Ohne SDS8 betrug die SNV-Akkumulation in SDS in Kolonien, sowohl mit als auch ohne Treibermutationen, ~15 Substitutionen pro Jahr (CI95 % = 13–17, lineares Mixed-Effects-Modell, p = 1 × 10–13, Abb. 4a), vergleichbar zu dem, was für eine gesunde Hämatopoese berichtet wurde1,2,3,39,40,41. Im Gegensatz dazu war die SNV-Belastung in SDS8-Kolonien mehr als doppelt so hoch wie für das Alter erwartet (p = 6,867e−13, Mittelwert = 905, Bereich = 857–933, verglichen mit erwarteten 496, Abb. 4a, c). Um zu beurteilen, welche Mutationsprozesse diesen Anstieg der Mutationslast in SDS8 auslösen könnten, haben wir auf Mutationssignaturen in der gesamten Kohorte geschlossen. Ähnlich wie bei gesundem/Nicht-SDS-Blut identifizierten wir zwei Mutationssignaturen: SBS142,43, gekennzeichnet durch spontane Desaminierung von Cytosinen; und „SBSBlood“, das typische endogene Mutationen in HSCs1,2,41 identifiziert (Abb. 4b). Biallelische TP53-mutierte/CNA-Genome aus SDS8 wiesen einen wesentlich höheren Anteil und eine wesentlich höhere Gesamtlast an SBS1-Mutationen auf (Mittelwert = 41 %, Bereich = 37–45 %) als für das Alter erwartet (erwartet = 12 %; Abb. 4c). Da bekannt ist, dass SBS1-Mutationen während der Zellteilung auftreten, deutet dieser Anstieg der SBS1-Mutationen in SDS8 im Vergleich zu anderen SDS-Individuen auf eine sehr schnelle klonale Expansion hin.

Als nächstes untersuchten wir, wann der Übergang zur schnellen klonalen Expansion bei SDS8 im Vergleich zum klinischen Erscheinungsbild bei MDS begonnen haben könnte. Die kürzeren Endzweige der klonalen Expansion in SDS8 wiesen ein ausgeprägtes Mutationsprofil auf (ergänzende Abbildung 4a), das durch einen deutlichen Anstieg von SBS1 gekennzeichnet war (65 % der Mutationen in Endzweigen, ergänzende Abbildung 4b). Der gemeinsame Stamm der SDS8-Phylogenie ähnelte eher dem Mutationsspektrum anderer Individuen ähnlichen Alters in der Studie, allerdings mit einem leichten Anstieg von SBS1 (27 % der gemeinsamen Mutationen) (ergänzende Abbildung 4a, b). Dies erhöhte die Möglichkeit, dass der Übergang vom normalen Mutationserwerb oder den normalen Zellteilungsraten in SDS8 zu einer schnellen klonalen Expansion irgendwann entlang des gemeinsamen Stammes der SDS8-Phylogenie stattfand. Um abzuschätzen, wann entlang dieses gemeinsamen Zweigs ein solcher Übergang stattgefunden haben könnte, haben wir das Mutationsspektrum des gemeinsamen Zweigs in die Summe zweier Mutationsprofile zerlegt – das Mutationsprofil der SDS-Hämatopoese, das bei anderen SDS-Individuen ähnlichen Alters beobachtet wurde (zusammengesetzt). altersangepasste SDS-Signatur) und das Mutationsspektrum in den privaten Endzweigen von SDS8 (Transformationssignatur), wie unter „Methoden“ beschrieben. Durch die Kombination dieser beiden Profile wurde das Mutationsspektrum des gemeinsamen Stamms genau rekonstruiert (zusammengesetzte altersangepasste SDS-Signatur 0,80, Transformationssignatur 0,20, Kosinusähnlichkeit 0,958, Methoden, ergänzende Abbildung 4c). Dies liefert eine grobe Schätzung, wann ein schnelles Wachstum begonnen haben könnte, unter der Annahme, dass dies zu einem einzigen historischen Zeitpunkt stattfand und auf ein sehr junges Transformationsalter von 23,5 Jahren (95 %-KI 19,2–24,9) schließen lässt. Selbst die untere Grenze dieser Altersspanne deutet auf ein schnelles klonales Wachstum hin. Unter der Annahme eines sehr einfachen Modells eines einzelnen Klons, der sich mit konstanter Geschwindigkeit zur klonalen Dominanz ausdehnt (siehe „Methoden“), würde man darauf schließen lassen, dass dieser Klon um 5200 % (150 %–15.000 %) pro Jahr wuchs, was dem mutierten HSC entspricht Die Klongröße verdoppelt sich etwa alle 2 Monate. Diese Daten verdeutlichen die potenziell schnelle Transformation zu MDS bei dieser Person mit SDS und liefern eine mögliche Erklärung für den oft abrupten Krankheitsverlauf, der klinisch beobachtet werden kann. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass wir die Transformation zu MDS nur bei einer einzelnen Person charakterisiert haben. Die Analyse weiterer Personen ist erforderlich, um den Weg zur Krankheitstransformation bei SDS zuverlässig abschätzen zu können. Interessanterweise fanden wir keine Hinweise darauf, dass heterozygote TP53-mutierte Kolonien in der gesamten Kohorte die Mutationslast erhöhten (lineares gemischtes Modell p = 0,22, alle Vergleiche mit TP53: Tukey p ≥ 0,87), was darauf hindeutet, dass die in SDS8 beobachtete schnelle klonale Expansion und Aberrationen der Kopienzahl beobachtet wurden wurden durch eine biallelische Mutation von TP53 und/oder die vorhandenen Chromosomenaberrationen verursacht.

Mutationen im EIF6-Gen verleihen SBDS-defizienten Zellen einen Fitnessvorteil8,18,21,44. Von den 13 identifizierten EIF6-Mutationsereignissen wurden Startcodon-Verlust (M1T), Missense-Mutationen (I58T, R96W, N106S), Nonsense-Mutationen (L121*, L104*), Frameshift-Trunking-Mutationen (V182fs*5) und Deletionen beobachtet. Während R96W und M1T mit klonalen Expansionen in Zusammenhang standen, betrafen die übrigen Ereignisse einzelne Kolonien. Die Unterschiede sowohl in den somatischen Varianten als auch in der Klongröße lassen auf unterschiedliche funktionelle Auswirkungen einzelner EIF6-Mutationen schließen.

Um die funktionellen Konsequenzen von eIF6-Mutationen auf den Ribosomenaufbau zu untersuchen, haben wir die Reste I58, N106 und R96 auf die 2,4 Å Kryo-EM-Struktur des menschlichen eIF6-60S-Komplexes (PDBID: 7OW7) abgebildet (Abb. 5a – d). Der eIF6-Rest N106 liegt an der Schnittstelle zwischen eIF6 und dem 60S-ribosomalen Untereinheitsprotein uL14 und bildet Wasserstoff (H)-bindende Wechselwirkungen mit den Rückgratsauerstoffatomen der uL14-Reste A133 und A136 (Abb. 5b). N106S reduziert wahrscheinlich die Wasserstoffbrückenbindungsschnittstelle zwischen eIF6 und uL14, um dessen Dissoziation zu unterstützen21. In ähnlicher Weise geht die Seitenkette des Rests I58 hydrophobe Wechselwirkungen mit uL14 ein, während der Sauerstoff der Hauptkette von I58 eine intra-Protein-H-Bindung mit dem Hauptketten-Stickstoff von R61 bildet, der wiederum eine Reihe von intra-Protein-H-Bindungen mit bildet die Seitenketten- und Rückgratatome von N106 (Abb. 5c). Der Ersatz von Isoleucin durch die polarere Threonin-Seitenkette in der I58T-Variante kann die Solvatisierung erhöhen und die Stabilität der eIF6-uL14-Schnittstelle verringern. Tatsächlich verringern die eIF6-Varianten I58T und N106S die Affinität von eIF6 für die 60S-Untereinheit in Hefe-, Dictyostelium- und menschlichen Zellen8,21. In ähnlicher Weise stabilisiert die Seitenkette von R96 die polare Wechselwirkung zwischen eIF6 (Rest D78) und dem ribosomalen Protein eL24 (Rest K2), die wahrscheinlich durch den Ersatz von Arginin durch Tryptophan in der R96W-Variante verloren geht (Abb. 5d).

ein Atommodell von menschlichem eIF6, gebunden an die ribosomale 60S-Untereinheit (PDBID: 7OW7). Zentraler CP-Vorsprung. Es wird vorhergesagt, dass stabilisierende Wechselwirkungen, die durch die eIF6-Reste N106 (b), I58 (c) und R96 (d) gebildet werden, bei somatischer Mutation verloren gehen. Die Abbildungen wurden mit Pymol v1.2 generiert. eL24 ist farbiger Lachs; uL14, Gold; eIF6, grün. eZellextrakte aus HEK293T-Zellen, die 24 Stunden lang einen leeren Vektor, eine humane eIF6-WT-FLAG- oder eine eIF6-M1T-FLAG-Mutante exprimierten, wurden einem Immunoblot unterzogen, um eIF6, FLAG und Actin als Ladungskontrolle nachzuweisen. f, g Überexpression von eIF6-Varianten in WT-Fliegen. Die Genotypen der Fliegenproben sind in der Ergänzungstabelle 2 angegeben. f Extrakte von Larven mit den angegebenen Genotypen wurden einem Immunoblot unterzogen, um die angegebenen Proteine ​​nachzuweisen (mindestens 3 Replikate). Kontrolle, da-GAL4-Leitung. g Anteil der angegebenen Fliegengenotypen, die geschlüpft sind (mindestens 5 Replikate, mindestens n = 216; Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SD dar). h Genetische Komplementation von Sbds-defizienten Drosophila (Sbds P/P) mit SDS-verwandten eIF6-Varianten. Dargestellt ist der Anteil der angegebenen Genotypen, die sich bis zum Puppenstadium entwickeln (mindestens 5 Replikate, mindestens n = 256; Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SD dar; ***zweiseitiger t-Test, p(1) = 0,00060711; p(2) = 2,56426 E−07; p(3) = 2,3141E−13. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Expression der eIF6-M1T-Variante zu beurteilen, führten wir ein Immunblotting von Extrakten aus menschlichen HEK293T-Zellen durch, die Wildtyp- (WT) oder FLAG-markiertes eIF6-M1T-Protein exprimieren. Wir haben bestätigt, dass die Startcodon-Verlustvariante eIF6-M1T die eIF6-Expression wie erwartet signifikant reduziert (Abb. 5e), was weiter darauf hindeutet, dass eine Untergruppe der EIF6-Missense-Varianten die Dosis von eIF618,21 reduziert. Es ist auch zu erwarten, dass Nonsens-Varianten (L104*, L121*), deletionsverursachende Frameshift-Mutationen oder genomische eIF6-Deletionen die eIF6-Dosis aufgrund der EIF6-Haploinsuffizienz verringern. Immunoblotting von Drosophila-Larvenzellextrakten ergab, dass die Expression der eIF6-I58T- und eIF6-N106S-Mutanten mit der von eIF6-WT vergleichbar war, die Expression der eIF6-R96W-Variante jedoch verringert war (wie durch Anti-FLAG-Antikörper nachgewiesen) (Abb. 5f). . Die gesamte eIF6-Expression (FLAG-markierte Variante plus endogenes eIF6-Protein), wie durch Anti-eIF6-Antiserum nachgewiesen, war für die Varianten eIF6-WT, eIF6-I58T oder eIF6-N106S vergleichbar, für eIF6-R96W jedoch nicht nachweisbar (Abb. 5f unten). . Diese Daten weisen darauf hin, dass die transgene Überexpression von eIF6 WT oder Varianten die Expression des endogenen eIF6-Proteins nicht signifikant induziert. Wichtig ist, dass eine Überexpression von WT-eIF6, jedoch nicht der eIF6-Varianten (N106S, R96W und I58T), die Lebensfähigkeit von WT-Fliegen verringert (Abb. 5g), was weiter zeigt, dass eine Überexpression von eIF6-Varianten nicht zu einer funktionell signifikanten Induktion des endogenen Drosophila-eIF6 führt Eiweiß.

Als nächstes testeten wir die Fähigkeit der Mutanten eIF6-I58T, eIF6-R96W und eIF6-N106S, die Larvenletalität von Drosophila21 mit SBDS-Mangel (Sbds P/P) im Vergleich zu WT eIF6 zu retten. Homozygote Sbds-defiziente Fliegen zeigten einen schweren Wachstumsdefekt, wobei nur 5 % der Larven bis zum frühen Puppenstadium überlebten (Abb. 5h). Während Wildtyp-eIF6 den tödlichen Sbds-defizienten Phänotyp nicht retten konnte, retteten eIF6-R96W, eIF6-N106S und in geringerem Maße eIF6-I58T einen Teil der Fliegen, die bis zum späten Puppenstadium überlebten (Abb. 5h). . Zusammen mit früheren genetischen Experimenten in Hefe8 deuten unsere Daten darauf hin, dass verschiedene eIF6-Varianten eine signifikante, aber variable zelluläre Rettungswirkung bei SDS aufweisen. Wir kommen zu dem Schluss, dass somatische EIF6-Mutationen den Ribosomenreifungsdefekt in SDS kompensieren, indem sie entweder die in der Zelle vorhandene Kopienzahl des EIF6-Gens verringern oder den Spiegel des eIF6-Proteins oder seine Bindungsfunktion an die 60S-Untereinheit modulieren, was zu einer zumindest teilweisen Wiederherstellung des Ribosoms führt Homöostase bei SDS.

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass der starke selektive Druck zur Überwindung einer gestörten Ribosomenbiogenese und zur Vermeidung des p53-vermittelten Zelltods bei SDS zu konvergenten somatischen Mutationen in einem einzigartigen Satz von Zielgenen führt, die im Zusammenhang mit dem Altern nicht beobachtet werden45,46,47 oder hämatologische Störungen wie Autoimmunität48 oder Chemotherapie49. Der durch solche Mutationen verliehene Überlebensvorteil führt zu klonalen HSC-Expansionen, die bei Personen mit SDS oft schon sehr früh im Leben beginnen, sogar in der Gebärmutter. Wir schätzen, dass im jungen Erwachsenenalter und sogar in der Kindheit fast die Hälfte der Hämatopoese von einer kleinen Anzahl expandierter HSCs stammt. Dies steht in krassem Gegensatz zur Hämatopoese bei gesunden Personen, die erst in den letzten Lebensjahrzehnten eine vergleichbare Oligoklonalität entwickeln3,5.

Wir gehen davon aus, dass das Repertoire an Zielgenmutationen unter Selektionsdruck bei SDS mehrere Wege zu einer verbesserten klonalen Fitness aufzeigt (Abb. 6a, b). Mutationen können direkt kompensatorisch sein, indem die Gendosis von SBDS oder EFL1 erhöht wird (Abb. 6b, „1“). Der in dieser Studie beobachtete Anstieg der Kopienzahl des EFL1-Gens aufgrund der strukturellen Aberration des Chromosoms 15 (im Zusammenhang mit Keimbahn-SBDS-Mutationen) unterscheidet sich von den somatischen Änderungen der Kopienzahl des EFL1-Gens aufgrund einer uniparentalen Disomie, über die in SDS-Fällen berichtet wurde, die durch die Keimbahn verursacht wurden EFL1-Mutationen17. Adaptive somatische Mutationen, die die Kopienzahl des EIF6-Gens reduzieren, den Spiegel des eIF6-Proteins verringern oder seine Bindungsaktivität an die 60S-Untereinheit verändern, können den Bedarf an funktionellem SBDS und EFL1 zur Freisetzung von eIF6 aus der ribosomalen 60S-Untereinheit senken (Abb. 6b, „2“ ). Es ist zu erwarten, dass jeder dieser Wege zur Wiederherstellung der Ribosomenhomöostase beiträgt. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese verbesserte Fitness im Zusammenhang mit dem SDS-Erkrankungszustand steht und obwohl die somatische SBDS-Gendosis erhöht sein kann, handelt es sich hierbei um eine hypomorphe Allelvariante, von der erwartet wird, dass sie nur teilweise restaurativ ist. Ebenso ist eine Veränderung der EIF6-Genkopie oder eine Veränderung der Funktion restaurativ, allerdings im Zusammenhang mit einem SBDS-Mangel. Somit würden weder eine Wiederherstellung noch andere festgestellte Änderungen notwendigerweise alle Funktionsmängel der hämatopoetischen SDS-Zellen beheben.

a Defekte Keimbahn-Ribosomenanordnung im SDS fördert nukleolären Stress durch inhibitorische Bindung des 5S-RNP-Komplexes (bestehend aus der 5S-rRNA, uL5, kodiert durch RPL11 und uL18, kodiert durch RPL5) an die nukleare E3-Ligase HDM2 (verstärkt durch eL22, kodiert durch). RPL22) fördert die p53-Akkumulation und Apoptose22. b Die konvergente Evolution somatischer Mutationen stellt die Homöostase der Ribosomen wieder her und begünstigt die HDM2-abhängige Ubiquitinierung und den Abbau von p53 durch mehrere unabhängige somatische genetische Rettungsereignisse, darunter: (1) erhöhte Dosis von SBDS- oder EFL1-Proteinen (2) verringerte eIF6-Dosierung oder eIF6-Bindung an die 60S Untereinheit; (3) gestörte inhibitorische Bindung von HDM2 an p53 durch Mutationen in RPL5 und RPL22 50; (4) TP53-Mutationen. Ub-Ubiquitin.

Eine fehlerhafte Ribosomenanordnung aktiviert die p53-induzierte Apoptose über den nukleolären Überwachungsweg. Die ribosomalen Proteine ​​uL18 (kodiert durch RPL5) und uL5 (kodiert durch RPL11) binden an die 5S-RNA und bilden den präribosomalen 5S-Ribonukleoprotein-Komplex (5S-RNP), der die E3-Ubiquitin-Ligase HDM2 hemmt, um das p53-Protein22 zu stabilisieren (Abb. 6a). ). eL22 (kodiert durch RPL22) kann auch die HDM2-p53-Schaltung50 hemmen. Daher können somatische Mutationen in Regulatoren des nukleolären Signalwegs wie RPL5 und RPL22 die durch nukleolären Stress induzierte Stabilisierung von p53 stören (Abb. 6c, „3“), oder Mutationen in TP53 selbst können dazu führen, dass Zellen trotz anhaltender Beeinträchtigung der Proteinsynthese überleben (Abb. 6b, '4'). Die Identifizierung wiederkehrender Mutationen in RPL5 und RPL22 in dieser Studie könnte auf die Verwendung der Gesamtgenomsequenzierung im Vergleich zum Exomsequenzierungsansatz von Kennedy et al.18 zurückzuführen sein. Obwohl eher spekulativ, können Mutationen im evolutionär konservierten Spleißfaktor PRPF8 auch das Spleißen von Komponenten der p53-HDM2-Achse, einschließlich uL18, uL5 oder p53 selbst, stören51. Die wiederkehrenden CSNK1A1-Mutationen, die von Kennedy et al.18 (jedoch nicht in dieser Studie) identifiziert wurden, könnten möglicherweise die Rolle der Kaseinkinase bei der Reifung der 40S-ribosomalen Untereinheit widerspiegeln52.

Eine somatische Mutation erleichtert den Eintritt der Treibermutation und stellt ein Substrat für die klonale Selektion bereit. Schätzungen der HSC-Anzahl bei gesunden Menschen deuten darauf hin, dass im Erwachsenenalter 50.000–200.000 eindeutig identifizierbare und aktiv beitragende HSCs vorhanden sind1,3. Da einzelne HSCs etwa 15 somatische Mutationen pro Jahr anhäufen1,3, würde man erwarten, dass etwa 1–3 Millionen somatische Mutationen pro Jahr in den HSC-Pool gelangen, von denen etwa 10.000–30.000 jedes Jahr in der kodierenden Reihenfolge landen würden. Diese Anzahl erwarteter Mutationen ist immer noch größer als der kodierende Fußabdruck vieler Gene, was es plausibel macht, dass eine nicht-synonyme somatische Mutation in einem einzelnen Gen wie TP53 (CDS-Länge 1182 bp) in jeweils einem HSC innerhalb des Stammzellpools landen könnte Jahr. Daher ist die Wahrscheinlichkeit einer stochastischen somatischen Mutation von Genen in HSCs sehr wahrscheinlich deutlich höher als angenommen, was zu einem umfassenden somatischen Mosaik innerhalb unseres HSC-Pools führt. Dies erklärt möglicherweise die hohe Prävalenz und das Wiederauftreten von Treibermutationen bei Personen mit SDS, wenn eine starke Selektion vorliegt, die ihre klonale Expansion nach der Akquisition erleichtert. Eine interessante Hypothese, die es zu testen gilt, ist, ob die Anzahl der somatischen Mutationen, die bei SDS-Fällen in jungen Jahren beobachtet werden, zumindest teilweise die Unfähigkeit des Immunsystems bei SDS widerspiegeln könnte, unerwünschte Zellen mit Treibermutationen zu beseitigen.

Die stochastische Natur des Erwerbs somatischer Treibermutationen aus dem frühen Leben könnte auch die beträchtliche Heterogenität im klinischen Phänotyp erklären, selbst bei Geschwistern mit SDS und demselben Keimbahn-Genotyp13. Der Nachweis einer starken klonalen Selektion wurde nicht bei allen Personen mit SDS erbracht, da drei Personen in der Kohorte keine nachweisbaren klonalen Erweiterungen oder Treibermutationen aufwiesen (Abb. 2). SDS1 war das jüngste Individuum in unserer Kohorte (4,2 Jahre) und hatte daher möglicherweise weniger Zeit, Treibermutationen und klonale Erweiterungen zu erwerben. Alternativ könnten klonale Erweiterungen aufgrund einer Kombination aus der geringen Probengröße (n = 18 Kolonien) und der bei jüngeren Individuen zu erwartenden größeren klonalen HSC-Diversität übersehen worden sein3. SDS3 war das einzige Individuum ohne das SBDS-Allel c.183_184TA > CT und trug stattdessen zwei SBDS-Keimbahnmutationen (c.258 + 2T > C, c.258 + 1G > C), die die Intron-2-Donor-Spleißstelle stören7. SDS9 war eine der älteren Personen in unserer Kohorte (26,2 Jahre) und ähnliche Personen ohne Treibermutationen wurden auch von Kennedy et al.18 beobachtet. In Zukunft wird es interessant sein zu bestimmen, ob Personen, die eine Markaplasie entwickeln, eine spezifische Untergruppe der SDS-Krankheitsentwicklung darstellen, bei der die durch Treibermutationen vermittelte klonale Expansion nicht ausreicht, um den Phänotyp des Knochenmarkversagens zu mildern.

Obwohl unsere Studie aufgrund der kleinen Kohorte der eingeschlossenen Personen und des Fehlens von Längsschnittproben begrenzt ist, werden Technologien wie die Einzelmolekülsequenzierung39,53 die Notwendigkeit klonaler Erweiterungen zum Nachweis von Treibermutationen umgehen, was zur Aufklärung des gesamten Spektrums der Zielgene beitragen kann die für Fitness im SDS sorgen. Die Charakterisierung verschiedener angeborener Knochenmarksversagensstörungen kann uns auch helfen, die Art des selektiven Vorteils zu verstehen, der durch Treibermutationen im Zusammenhang mit der klonalen Hämatopoese entsteht, die gelegentlich in dieser und einer früheren Studie beobachtet wurden18.

Klinisch verdienen Personen mit SDS eine sorgfältige Überwachung neu auftretender Klone mittels regelmäßiger erweiterter Gensequenzierung im Blut, angesichts der großen Anzahl monoallelischer TP53-Klonerweiterungen, die viele haben und die jeweils potenziell als Substrat für die klonale Entwicklung zu aggressiven Krankheiten dienen. Unsere Studie und andere18 legen nahe, dass ein Schlüsselmechanismus der Transformation bei SDS der Erwerb von biallelisch mutiertem TP53 ist. Angesichts des beobachteten sehr schnellen klonalen Wachstums und der beobachteten genomischen Evolution kann angesichts der schlechten Prognose, die mit TP53-mutierten myeloischen Krebsarten35,54,55,56,57,58 und transformierten Erkrankungen einhergeht, die Erwägung eines frühen therapeutischen Eingriffs, wie z. B. einer Knochenmarktransplantation, gerechtfertigt sein in SDS36.

Unsere Forschung entspricht allen relevanten ethischen Vorschriften. Personen mit SDS (n = 10) wurden nach vollständiger Genehmigung und Einwilligung des Forschungsethikausschusses prospektiv in die Studie einbezogen (Genehmigungen des NHS-Forschungsethikausschusses 07/MRE05/44 (Cambridge South), 11/LO/0512 (London Riverside), 12/ EE/0478 (Ostengland)). Jede Person wurde zu einem Zeitpunkt beprobt, mit Ausnahme von SDS5, bei dem die Beprobung zu zwei Zeitpunkten erfolgte. Das Material umfasste peripheres Blut und/oder Knochenmark sowie Mundschleimhautabstriche für jede Person. Die Probensammlung, die anfängliche Probenverarbeitung und das Proben-Banking wurden von der Cambridge Blood and Stem Cell Biobank mit der entsprechenden Genehmigung des NHS Research Ethics Committee (18/EE/0199 (Ostengland)) durchgeführt. Die Patienten gaben eine schriftliche Einverständniserklärung zur Verwendung der Materialien für die Forschung ab hier vorgenommen und die Ergebnisse entschädigungslos veröffentlicht.

Die durchflusszytometrische Immunphänotypisierung von HSPCs wurde an gelagerten gefrorenen lebensfähigen mononukleären Zellen (MNCs) aus PB- und/oder BM-Proben durchgeführt, die von Personen mit SDS im Alter von 4–33 Jahren oder von gesunden/Nicht-SDS-Spendern im Alter von 29–32 Jahren (STEMCELL Technologies) stammten. . MNCs von gesunden (nicht SDS) Spendern wurden mit Antikörpern gefärbt: CD3-FITC (Klon HIT3a, BD #555339; Verdünnung 1:500), CD90-PE (Klon 5E10, Biolegend, #328114; 1:33), CD49f- PECy5 (Klon GoH3, BD #551129; 1:100), CD38-PECy7 (Klon HIT2, Biolegend, #303516; 1:100), CD33-APC (Klon WM53, BD #571817; 1:200), CD19-A700 (Klon HIB19, Biolegend #302226; 1:300), CD34-APCCy7 (Klon 581, Biolegend #343514; 1:100), CD45RA-BV421 (Klon HI100, Biolegend #304130; 1:100) und Zombie Aqua (Biolegend #423101; 1:2000). MNCs von Personen mit SDS wurden mit den folgenden Antikörpern gefärbt: CD38-FITC (Klon HIT2, BD #555459; 1:12,5), CD34-PE-Cy7 (Klon 8G12, BD #348811; 1:33), CD10-BV605 ( Klon HI10a, Biolegend #312222: 1:33), CD45RA-V450 (Klon HI30, BD #560367; 1:100), CD90 APC (Klon 5E10, Biolegend #328110; 1:50), CD3-APC-Cy7 (Klon SK7, Biolegend #344818; 1:50) und CD19-APC-Cy7 (Klon HIB19, Biolegend #302218, 1:50). Nach dem Gating für lebende Singuletts (7AAD oder Zombie-negativ) und dem Ausschluss von CD3/CD19-positiven Zellen wurden CD34-positive Vorläufer in großen Mengen gegatet (ergänzende Abbildung 1).

Frühere Studien haben gezeigt, dass mutierte klonale Fraktionen gleichwertig sind, wenn Stammzellen oder Vorläufer aus peripherem Blut oder Knochenmark stammen1,3. PB- oder BM-Proben wurden in Lithium-Heparin-Röhrchen (LiHep) gesammelt, MNCs wurden durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert und Erythrozyten wurden in NH4Cl lysiert. Zellen aus der MNC-Fraktion (oder CD34+-Zellen für ein Individuum) wurden zur In-vitro-Kultur und klonalen Expansion (Assay auf koloniebildende Zellen (CFC)) in MethoCult H4435 (STEMCELL) ausplattiert, wobei ein breites Spektrum an Zellverdünnungen verwendet wurde, um eine angemessene Konzentration sicherzustellen Aussaatdichte zum Pflücken von Einzelzellkolonien. Nach 2–3 Wochen im CFC-Assay wurden einzelne hämatopoetische Kolonien in PBS- oder ProteinaseK-Puffer (Arcturus Picopure DNA Extraction Kit, Applied Biosystems) aufgenommen und für die anschließende Sequenzierung der gesamten Genom-DNA (WGS) bei –20 °C gelagert (Abb . 1). In zwei Proben wurden Einzelzell-Flüssigkulturen mit einzelnen lin-CD34+CD38+CD90-Zellen unter Verwendung der folgenden Antikörper initiiert: CD38-FITC (Klon HIT2, BD, San Jose, CA, USA; #555459; 1:12,5) , CD34 PerCp-Cy5.5 (Klon 581, Biolegend #343522; 1:33, San Diego, USA, CD90-APC (Klon 5E10, Biolegend #328114; 1:33), nach Voranreicherung für CD34+-Zellen (EasySep Human CD34 Positive Selection Kit, STEMCELL). Einzelne HSPCs (lin−CD34+CD38+CD90−) wurden mit einem BD Influx Sorter durchflusssortiert und in StemSpan, ergänzt mit Zytokinen und rekombinanten Wachstumsfaktoren SCF, FLT3L, IL3 und IL6 (cc100, STAMMZELLE).

DNA aus gepflückten CFC-Kolonien wurde mit dem Arcturus Picopure DNA-Extraktionskit (Applied Biosystems) extrahiert. Für die Extraktion aus in PBS aufgenommenen CFC-Kolonien wurde das DNAeasy-Kit (Qiagen) verwendet. DNA aus Mundschleimhautabstrichen wurde mit dem QIAmp DNA Micro Kit (Qiagen Kat. 56304) isoliert.

Einzelne Kolonien wurden einer Sequenzierung des gesamten Genoms unterzogen, um somatische Einzelnukleotidvarianten (SNVs), Keimbahnvarianten, Insertionen/Deletionen und Strukturvarianten zu identifizieren. Wir haben 150-bp-Paired-End-Sequenzierungs-Reads mit Illumina Die Sequenzen wurden mithilfe des BWA-MEM-Algorithmus59,60 an das menschliche Referenzgenom GRCh37d5 angepasst. Nach der Entfernung von Kolonien aufgrund der geringen Sequenzierungstiefe (weniger als 6x) und der geringen Klonalität (mittlere Allelvariantenhäufigkeit von weniger als 0,4) wurden 323 Kolonien (Bereich 10–100 pro Individuum, Mittelwert 32 pro Individuum) zur weiteren Sequenzierung übernommen Analyse.

Einzelnukleotidvarianten (SNV) wurden mithilfe von CaVEMan61 für jede Kolonie durch Vergleich mit einer nicht übereinstimmenden In-silico-Probe (PD37Is) identifiziert. CaVEMan wurde mit dem Parameter „normale Kontamination des Tumors“ auf Null und einer Anzahl von Tumoren/normalen Kopien von 5/2 ausgeführt. Zusätzlich zu den Standardfiltern mussten Lesevorgänge, die einen SNV unterstützen, einen mittleren BWA-MEM-Alignment-Score von ≥ 140 aufweisen und weniger als die Hälfte der Lesevorgänge mussten abgeschnitten sein. Es wurde auch eine Filterung zur Qualitätskontrolle nach der Verarbeitung durch die Sanger-Low-Input-Sequenzierungspipeline angewendet62. Die Verwendung des unübertroffenen Normalwerts führte dazu, dass dieser Prozess sowohl somatische als auch Keimbahn-SNVs hervorrief. Die Entfernung von Keimbahn-SNVs und Sequenzierungsartefakten erforderte eine weitere Filterung. Wie veröffentlicht4, haben wir gepoolte Informationen über Kolonien hinweg verwendet und Zählungen aus einer passenden Keimbahn-WGS-Bukkalprobe abgelesen, um sicherzustellen, dass auch echte somatische Varianten vorhanden waren, die in der Keimbahnprobe entweder als embryonale Varianten oder aufgrund einer Tumor-in-normalen Kontamination vorhanden sein könnten identifiziert. Kurze Einfügungen und Löschungen wurden mit cgpPindel63 aufgerufen, wobei die Standard-WGS-cgpPindel-VCF-Filter angewendet wurden, mit der Ausnahme, dass der Pindel-Filter F018 deaktiviert wurde, da er Orte mit einer Tiefe <10 ausschließt. Kopienzahl-Aberrationen (CNA) wurden mithilfe von ASCAT64 im Vergleich zu einer passenden Normalprobe identifiziert. Anschließend wurde die Vereinigung von Kolonie-SNVs und Insertions-Deletionen (Indels) erfasst und die Messwerte über alle zum Individuum gehörenden Proben (Kolonien und bukkale Proben) mithilfe von VAFCorrect gezählt.

Strukturvarianten (SVs) wurden von BRASS65 aufgerufen. Wir haben Artefakte aus den SV-Aufrufen mithilfe von AnnotateBRASS (https://github.com/MathijsSanders/AnnotateBRASS66) mit Standardeinstellungen entfernt.

Der Genotyp an jedem Ort innerhalb jeder Probe war entweder 1 (vorhanden), 0 (nicht vorhanden) oder NA (unbekannt). Wir haben den Genotyp tiefensensitiv abgeleitet. Wir gingen davon aus, dass die beobachtete Mutanten-Lesezahl für eine Kolonie an einer bestimmten Stelle MTR ~ Binomial (n = Tiefe, p = erwartetes VAF) war, wenn die Stelle mutiert war, und MTR ~ Binomial (n = Tiefe, p = 0,01), wenn Die Website war vom Wildtyp. Der Genotyp wurde auf den wahrscheinlichsten der beiden möglichen Zustände festgelegt, vorausgesetzt, einer der Zustände war mindestens 20-mal wahrscheinlicher als der andere. Andernfalls wird der Genotyp auf „fehlend“ (NA) gesetzt. Der erwartete VAF betrug normalerweise 0,5 für autosomale Stellen, für die Chromosomen X, Y und CNA-Stellen wurde er jedoch auf 1/Ploidie festgelegt. Für Standorte mit Verlust der Heterozygosität (LOH) wurde der Genotyp überschrieben und auf „fehlend“ gesetzt, wenn er ursprünglich 0 war.

Mit MPBoot67 haben wir phylogenetische Baumtopologien mit maximaler Sparsamkeit erstellt. Die Eingaben für MPBoot waren die binären Genotypmatrizen mit fehlenden Werten pro Individuum. Zur Ableitung der Topologie wurden nur SNVs verwendet, anschließend wurden jedoch sowohl SNVs als auch Indels den Zweigen phylogenetischer Bäume zugeordnet.

Anschließend wurden die Mutationen mithilfe von Treemut (https://github.com/nangalialab/treemut4) tiefensensitiv dem Baum zugeordnet, wobei die Mutationen dem Zweig mit der höchsten Wahrscheinlichkeit fest zugeordnet wurden. Darüber hinaus wurden die Verzweigungslängen an die verzweigungsspezifische SNV-Nachweisempfindlichkeit angepasst4, wobei die Empfindlichkeit der Erkennung vollständig klonaler SNV-Varianten direkt aus der Empfindlichkeit pro Kolonie für die Erkennung heterozygoter Keimbahn-SNVs zusammen mit einer multiplikativen Korrektur für die Klonalität (VAF) der abgeschätzt wurde Kolonien. Bei der Berechnung der Mutationslast und der Verzweigungslängen der Kopienanzahl werden Regionen, die in einer Kolonie eines Individuums vorhanden sind, in allen Kolonien für dieses Individuum einheitlich ausgeblendet, und dann wird die Gesamtmutationslast um den Kehrwert von 1 der erwarteten Anzahl von Mutationen in hochskaliert der maskierte Bereich.

Zusätzlich zu SNVs und Indels zeigten die Kolonien eine Vielzahl von LOH- und CNA-Ereignissen. Diese Ereignisse wurden als vorhanden oder nicht vorhanden in jeder der Kolonien kuratiert, was einen Ereignis-Genotyp-Vektor ergab, der dem für SNVs und Indels erhaltenen ähnelte. Nachdem die Baumtopologie mithilfe der SNV-Genotypen abgeleitet wurde, wurden die Zweige identifiziert, die genau mit dem Ereignis-Genotyp übereinstimmten, und das Ereignis dem entsprechenden Zweig zugeordnet.

Angesichts der linearen Häufung somatischer Mutationen mit dem Alter können wir auf den Zeitpunkt im Leben schließen, zu dem Treibermutationen in phylogenetischen Bäumen aufgetreten sind. Äste an der Spitze eines Baumes stellen Mutationen dar, die in jungen Jahren erworben wurden, während Äste weiter unten Mutationen darstellen, die später im Leben entstanden sind.

Wir haben eine formale modellbasierte Methode rtreefit (https://github.com/nangalialab/rtreefit) entwickelt, um Bäume, deren Zweiglängen in molekularer Zeit (dh Anzahl der Mutationen) ausgedrückt werden, in Bäume umzuwandeln, deren Zweiglängen in Einheiten ausgedrückt werden Zeit (Jahre)4. Kurz gesagt, die Methode passt eine einzelne konstante Mutationsrate (d. h. die Anzahl der pro Jahr akkumulierten SNVs) und die absoluten Zeitzweiglängen mithilfe eines Bayesian-Modells pro einzelnem Baum an, unter der Annahme, dass die Anzahl der beobachteten Mutationen, die einem Zweig zugeordnet sind, Poisson ist verteilt mit Mittelwert = Verzweigungsdauer × Sensitivität × Mutationsrate und unter der Einschränkung, dass die Wurzel-zu-Spitze-Dauer dem Alter bei der Probenahme entspricht. Darüber hinaus berücksichtigt die Methode eine erhöhte Mutationsrate während der Embryogenese, indem sie eine übermäßige Mutationsrate während der Entwicklung annimmt.

Der rtreefit-Algorithmus wurde mit 4 Ketten und 20.000 Iterationen pro Kette ausgeführt.

Wir suchten speziell nach Hotspot-Treibermutationen, Änderungen der Kopienzahl und Umlagerungen in 35 Genen, von denen bekannt ist, dass sie mit hämatologischer Malignität35 und klonaler Hämatopoese33,34 assoziiert sind (ASXL1, BCOR, CALR, CBL, CSF3R, CUX1, DNMT3A, EZH2, GATA2, GNAS, GNB1). , IDH1, IDH2, JAK2, KIT, KRAS, MLL3, MPL, NF1, NFE2, NRAS, PHF6, PPM1D, PTPN11, RB1, RUNX1, SETBP1, SF3B1, SRSF2, SH2B3, STAG2, TET2, TP53, U2AF1, ZRSR2) als sowie in den in SDS identifizierten wiederkehrend mutierten Genen. Wir haben somatische Mutationen unter positiver und negativer Selektion mithilfe von dNdScv68 identifiziert.

Wir haben die in unserem Datensatz vorhandenen Mutationsprofile charakterisiert, indem wir eine Signaturextraktion mit hdp (https://github.com/nicolaroberts/hdp) ohne Signaturen wie zuvor und ohne spezifizierte Gruppierung der Daten durchgeführt haben. Um Doppelzählungen zu vermeiden, wurden Mutationen, die zwischen den Kolonien gemeinsam waren, zufällig einer Kolonie zugeordnet. hdp identifizierte das Vorhandensein von zwei Mutationssignaturen, eine mit starker Ähnlichkeit zu den kosmischen Signaturen SBS142 (Kosinus-Ähnlichkeit ≥0,95) und eine mit starker Ähnlichkeit zu SBSblood1,2,41 (Kosinus-Ähnlichkeit ≥0,91). Anschließend haben wir den Anteil der in jeder Kolonie vorhandenen SBS1- und SBSblood-Mutationssignaturen mithilfe des Programms sigfit 69 geschätzt.

Wir definieren die Überdispersion der Mutationslast als das Verhältnis der erwarteten Lastvarianz zur Poisson-Varianz. Wir schätzen die Überdispersion als Funktion des Alters anhand von Daten aus gesunden/nicht aus SDS-Blut stammenden Einzelzellkolonien, die in Mitchell et al.3 berichtet wurden. Die individuelle Überdispersion zu jedem Zeitpunkt wird als Varianz der Probenmutationslast dividiert durch die mittlere Mutationslast der Probe geschätzt. Die logarithmische Überdispersion wurde dann mithilfe eines linearen Modells mit dem Alter als erklärender Variable modelliert. Die geschätzte Überdispersion im Alter von 25 Jahren beträgt 2,24 (1,85–2,73). Zur Beurteilung der statistischen Signifikanz der offensichtlich hohen SDS8-Mutationslast berücksichtigen wir konservativ den sehr hohen Grad an gemeinsamer Geschichte der SDS8-Kolonien, indem wir die Gruppe als Einzelzelle betrachten, deren Belastung durch die mittlere Belastung gegeben ist, und diese dann bewerten die Wahrscheinlichkeit, eine solch extreme Mutationslast (n = 905) zu beobachten, unter der Nullhypothese, dass Mutationen gemäß einer negativen Binomialverteilung mit einem Mittelwert gleich der erwarteten Anzahl von Mutationen (n = 496) und einer Varianz von 2,24 kumuliert wurden der Mittelwert.

Wir gehen davon aus, dass es ein einzelnes Transformationsereignis gibt, das einen Mutationsprozess auslöst, der für das in der erweiterten Gruppe beobachtete unterschiedliche Signaturprofil (Transformationssignatur) verantwortlich ist (ergänzende Abbildung 4). Anschließend schätzen wir den Zeitpunkt dieses Ereignisses als das Alter, das der Anzahl der Stammmutationen entspricht, die dem zusammengesetzten Signaturprofil der normalen SDS-Hämatopoese (SDS6, SDS7 und SDS9) (zusammengesetzte altersangepasste SDS-Signatur) zugeordnet werden können. Die Anzahl der angesammelten zusammengesetzten altersangepassten SDS-Signatur-Stammmutationen wird geschätzt, indem das R-Paket sigfit69 verwendet wird, um die Stamm-SNVs in Beiträge aus der zusammengesetzten altersangepassten SDS-Signatur und der Transformationssignatur zu zerlegen. Anschließend schätzen wir das entsprechende Alter mithilfe der Approximate Bayesian Computation mit der Ablehnungsmethode. Dabei muss die Anzahl der seit der Geburt erworbenen Substitutionen einer negativen Binomialverteilung folgen, mit einem Mittelwert = Alter bei Transformation × Mutationsrate und einer Varianz, die auf das 2,24-fache des Mittelwerts festgelegt ist (siehe Abschnitt oben). Die Mutationsrate selbst wird aus einer Normalverteilung mit einem Mittelwert von 15,1 und einer Varianz von 1 ermittelt. Die bedingungslose Altersschätzung verwendet einen einheitlichen vorherigen Altersbereich von 0–100 Jahren, während die bedingte Altersschätzung einen einheitlichen vorherigen Altersbereich von 0–25 Jahren verwendet. Wir schätzen einen ultrametrischen Baum mithilfe von rtreefit4 (wobei das Transformationsalter auf die untere Grenze des 95 %-KI für die bedingte Altersschätzung (19,3 Jahre) beschränkt ist). Anschließend wurde die Phylofit-Methode3 verwendet, um die Wachstumsrate des Klons anhand des Timings und Musters abzuschätzen von Koaleszenzen. Ausführliche Informationen finden Sie unter https://github.com/nangalialab/ShwachmanDiamond.

cDNA für menschliches eIF6 WT, das einen C-terminalen FLAG-Tag trägt, wurde durch PCR unter Verwendung des Phusion High-Fidelity PCR-Kits (NEB) generiert. Das PCR-Produkt wurde dann unter Verwendung der BamHI/XhoI-Stellen in pcDNA3.1 (Thermo Fisher Scientific) eingefügt, wodurch das Plasmid pEIF6-WT-FLAG entstand. Zur Erzeugung der eIF6-M1T-Mutante (Plasmid pEIF6-M1T-FLAG) wurde eine ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung des Phusion High-Fidelity PCR-Kits (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Die Grundierungen waren wie folgt (5' bis 3'):

eIF6-WT-Fw,TACTGGATCCATGGCGGTCCGAGCTTCGTTC

eIF6-WT-FLAG-Rev,AGTACTCGAGTCACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGGTGAGGCTGTCAATGAGGGAATC) eIF6-M1T-Fw,CGGATCCACGGCGGTCCGAGCTTCGTTCGAGAACAA

eIF6-M1T-Rev, GGACCGCCGTGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAA

HEK293T-Zellen (Sigma, 12022001) wurden in einer 12-Well-Schale bis zu einer Konfluenz von ~80 % gezüchtet, gefolgt von einer Plasmidtransfektion unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Thermo Fisher Scientific) für 24 Stunden. Die Zellen wurden in 1x PBS gewaschen und in 0,5 % NP-40 30 Minuten lang auf Eis lysiert. Die Lysate wurden 10 Minuten lang bei 21.130 × g zentrifugiert und der Überstand mit 50 mM DTT und 4x NuPAGE LDS-Probenpuffer (Thermo Fisher Scientific) auf 1x gemischt. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei 70 °C inkubiert. Die Proteine ​​wurden in einem NuPAGE 4–12 % Bis-Tris-Gel (Thermo Fisher Scientific) in 1x MES-Laufpuffer (Formedium) aufgetrennt, bevor sie mit dem iBlot 2-System (Thermo Fisher Scientific) auf eine Nitrozellulosemembran übertragen wurden. Die Membran wurde mit 5 % (w/v) Milch, gelöst in PBST-Puffer (1x PBS mit 0,1 % [v/v] Tween 20), 1 Stunde lang blockiert. Menschliche Proteine ​​wurden unter Verwendung von Anti-FLAG (Sigma, #F7425, 1:5000 Verdünnung), Anti-eIF6 (GenTex, #GTX117971) und Anti-Actin-Antikörpern (Sigma, #A2066), beide bei 1:1000 Verdünnung, sichtbar gemacht. Als sekundärer Antikörper wurde ein Anti-Kaninchen-IgG-HRP-gebundener Antikörper (Cell Signalling, Nr. 7074; 1:5000) verwendet. Blots wurden mit dem Western Chemiluminescent HRP-Substrat (Immobilon) entwickelt und mit dem Chemidoc™ MP (Bio-Rad) Bildgebungssystem sichtbar gemacht. Die Analyse wurde mit der Image Lab-Software v6.0.1 (Bio-Rad) durchgeführt.

Drosophila-Larven im dritten Stadium (typischerweise 15 Larven) wurden gesammelt, mit PBS gewaschen und in Lysepuffer (20 mM HEPES pH 7,4, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,5 % (v/v) IGEPAL® CA-630 (Sigma, #I8896), 0,5 % (w/v) Natriumdesoxycholat (Sigma, #30970) mit vollständigen EDTA-freien Proteaseinhibitoren (Roche) und 15 Minuten auf Eis inkubiert. Die Lysate wurden in einer Mikrozentrifuge bei 20.000 × g für 10 Minuten geklärt bei 4 °C. Gleiche Mengen (typischerweise 10 µg) des Gesamtproteins wurden geladen und mittels SDS-PAGE zum Immunblotting aufgetrennt. Drosophila-Proteine ​​wurden mit Anti-Gapdh (Merck #G9545, 1:20.000 Verdünnung), Anti-eIF6 (GeneTex) sichtbar gemacht , #GTX117971, 1:1000-Verdünnung) und Anti-FLAG-Antikörper (Abcam, 1:20.000-Verdünnung). Sekundärantikörper wurden alle in einer 1:10.000-Verdünnung verwendet: Anti-Maus-IgG, HRP-konjugiert (Sigma-A5287), Anti- Kaninchen-IgG, HRP-konjugierter (Cell Signaling 7074), Anti-Ziegen-IgG, HRP-konjugierter (Santa Cruz, sc-2020) Antikörper. Blots wurden mit dem SuperSignal™ West Pico PLUS Chemilumineszenzsubstrat (Thermo Fisher, Nr. 34580) entwickelt. und mit einem Chemidoc™ MP (Bio-Rad) Bildgebungssystem visualisiert. Die Analyse wurde mit der Image Lab-Software v6.0.1 (Bio-Rad) durchgeführt.

Die Fliegen wurden unter Verwendung von Standardkulturtechniken gehalten. Alle Kreuzungen wurden bei 25 °C durchgeführt. Fliegenstämme und Genotypen sind in den Ergänzungstabellen 2 und 3 beschrieben. Die Drosophila-Linien SbdsP, UAS-EIF6-FLAG, UAS-EIF6-R96W-FLAG, UAS-EIF6-N106S-FLAG sind in der Ergänzungstabelle 3 beschrieben. Um die UAS zu generieren -EIF6-I58T-FLAG transgene Linie, die kodierende Sequenz für Drosophila EIF6 (NM_145105) wurde durch PCR aus Drosophila-Larven-cDNA18 amplifiziert. Die Variante EIF6I58T wurde durch ortsspezifische PCR-Mutagenese erzeugt und in pTWF (The Drosophila Gateway Vector Collection) subkloniert, um das Plasmid pUAS-EIF6-I58T-FLAG für die Mikroinjektion zu erzeugen. Die transgene pUAS-EIF6-I58T-FLAG-Linie wurde durch P-Element-vermittelte Keimbahntransformation in den Stamm aw 1118 von BestGene Inc. erzeugt. Zur Erzeugung der Drosophila-Stämme wurden folgende Oligonukleotidprimer verwendet (5' bis 3'): EIF6-F: CACCATGGCTCTACGCGTCC; EIF6-R: GGACATGTCCTCGATGAGGGC; EIF6-I58T-F: CTGCCGGACAATCGGCCGCC; EIF6-I58T-R: GCCGATTGTCCGGCAGCCG. Die da-GAL4-Linie wurde verwendet, um die allgegenwärtige Expression von FLAG-markierten eIF6-Varianten unter dem UASt-Promotor zu induzieren.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Rohe Sequenzierungsdaten für alle gesamten Genome sind im Europäischen Genom-Phänomen-Archiv (Zugangsnummer EGAD00001009061) verfügbar. Der Zugriff auf diese im EGA gehosteten menschlichen Daten ist aus Sensibilitätsgründen eingeschränkt und wird daher im Einklang mit der Datenfreigaberichtlinie von Wellcome Sanger verwaltet . Forscher, die am Zugriff auf die Daten interessiert sind, sollten über eDAM2 (https://edam.sanger.ac.uk/) einen Antrag auf Datenzugriff bei Sanger einreichen. Weitere Einzelheiten finden Sie unter https://www.sanger.ac.uk/ about/edam2-guide/#02-04. Wenn eine Bewerbung eingeht, führt das Datenzugriffsteam verschiedene Prüfungen durch, z. B. die Identität des Bewerbers als seriöser Forscher, seine Zugehörigkeit und das Projekt, das er in seiner Bewerbung beschreibt im Einklang mit allen Nutzungsbeschränkungen steht, die mit den von ihnen angeforderten Datensätzen verbunden sind. Es gibt keine zeitliche Begrenzung für den Datenzugriff; die Datenzugriffsvereinbarungen sind unbefristet und laufen bis zur Kündigung. Der Datenzugriff wäre jedoch mit (1) verbunden ein bestimmtes Projekt, kann also nur für dieses Projekt verwendet werden, solange es läuft, und (2) die institutionelle E-Mail-Adresse des Forschers, sodass er bei einem Wechsel der Zugehörigkeit den Zugriff auf die Daten verlieren würde und die Daten erneut beantragen müsste Zugang unter ihrer neuen Zugehörigkeit. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Ein Repository des Codes zur Durchführung aller Analysen finden Sie unter https://github.com/machadoheather/somatic_evolution_SDS (https://doi.org/10.5281/zenodo.8172028)70 und https://github.com/nangalialab /ShwachmanDiamond (https://doi.org/10.5281/zenodo.8172581)71.

Lee-Six, H. et al. Populationsdynamik von normalem menschlichem Blut, abgeleitet aus somatischen Mutationen. Natur 561, 473–478 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Osorio, FG et al. Somatische Mutationen offenbaren Abstammungsbeziehungen und altersbedingte Mutagenese in der menschlichen Hämatopoese. Cell Rep. 25, 2308–2316.e4 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mitchell, E. et al. Klonale Dynamik der Hämatopoese über die gesamte menschliche Lebensspanne. Natur 606, 343–350 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Williams, N. et al. Aus Phylogenien abgeleitete Lebensgeschichten myeloproliferativer Neoplasien. Natur 602, 162–168 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Fabre, MA et al. Die Längsdynamik und der natürliche Verlauf der klonalen Hämatopoese. Natur 606, 335–342 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zink, F. et al. Klonale Hämatopoese mit und ohne potenzielle Treibermutationen kommt bei älteren Menschen häufig vor. Blut 130, 742–752 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boocock, GRB et al. Mutationen im SBDS sind mit dem Shwachman-Diamond-Syndrom verbunden. Nat. Genet. 33, 97–101 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Menne, TF et al. Das Shwachman-Bodian-Diamond-Syndrom-Protein vermittelt die translatorische Aktivierung von Ribosomen in Hefe. Nat. Genet. 39, 486–495 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Warren, AJ Molekulare Grundlagen der menschlichen Ribosomopathie Shwachman-Diamond-Syndrom. Adv. Biol. Regul. 67, 109–127 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Finch, AJ et al. Die Entkopplung der GTP-Hydrolyse von der eIF6-Freisetzung am Ribosom verursacht das Shwachman-Diamond-Syndrom. Genes Dev. 25, 917–929 (2011).

Artikel MathSciNet CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weis, F. et al. Mechanismus der eIF6-Freisetzung aus der entstehenden ribosomalen 60S-Untereinheit. Nat. Struktur. Mol. Biol. 22, 914–919 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jaako, P. et al. Die Neubindung von eIF6 koppelt dynamisch die Reifung und Translation von Ribosomen. Nat. Komm. 13, 1562 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Donadieu, J. et al. Klassifizierung und Risikofaktoren für hämatologische Komplikationen in einer französischen nationalen Kohorte von 102 Patienten mit Shwachman-Diamond-Syndrom. Haematologica 97, 1312–1319 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dror, Y. et al. Klonale Evolution im Knochenmark von Patienten mit Shwachman-Diamond-Syndrom: eine prospektive 5-Jahres-Follow-up-Studie. Exp. Hämatol. 30, 659–669 (2002).

Artikel PubMed Google Scholar

Parikh, S. et al. Erworbener Kopienzahl-neutraler Verlust der Heterozygotie von Chromosom 7 im Zusammenhang mit klonaler Hämatopoese bei einem Patienten mit Shwachman-Diamond-Syndrom. Br. J. Hämatol. 159, 480–482 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Minelli, A. et al. Das Isochromosom i(7)(q10), das die c.258+2t>c-Mutation des SBDS-Gens trägt, fördert nicht die Entwicklung myeloischer Malignome bei Patienten mit Shwachman-Syndrom. Leukämie 23, 708–711 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lee, S. et al. Die somatische uniparentale Disomie mildert die schädlichste EFL1-Allelkombination beim Shwachman-Diamond-Syndrom. Blut 138, 2117–2128 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kennedy, AL et al. Unterschiedliche genetische Signalwege definieren prämaligne versus kompensatorische klonale Hämatopoese beim Shwachman-Diamond-Syndrom. Nat. Komm. 12, 1334 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pressato, B. et al. Deletion des Chromosoms 20 im Knochenmark von Patienten mit Shwachman-Diamond-Syndrom, Verlust des EIF6-Gens und günstiger Prognose. Br. J. Hämatol. 157, 503–505 (2012).

Artikel PubMed Google Scholar

Valli, R. et al. Unterschiedlicher Materialverlust bei wiederkehrenden interstitiellen Deletionen des Chromosoms 20 beim Shwachman-Diamond-Syndrom und bei myeloischen Neoplasien. Mol. Zytogenet. 6, 56 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Tan, S. et al. Somatische genetische Rettung eines Keimbahn-Ribosomen-Assemblierungsdefekts. Nat. Komm. 12, 5044 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sloan, KE, Bohnsack, MT & Watkins, NJ Das 5S RNP koppelt die p53-Homöostase an die Ribosomenbiogenese und nukleolären Stress. Cell Rep. 5, 237–247 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Elghetany, MT & Alter, BP Die Überexpression des p53-Proteins in Knochenmarksbiopsien von Patienten mit Shwachman-Diamond-Syndrom weist eine ähnliche Prävalenz auf wie bei Patienten mit refraktärer Anämie. Bogen. Pathol. Labor. Med. 126, 452–455 (2002).

Artikel PubMed Google Scholar

Tourlakis, ME et al. In-vivo-Seneszenz in der Sbds-defizienten murinen Bauchspeicheldrüse: zelltypspezifische Folgen einer Translationsinsuffizienz. PLoS Genet. 11, e1005288 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zambetti, NA et al. Ein Mangel des Ribosomen-Biogenese-Gens Sbds in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen führt bei Mäusen zu Neutropenie, indem es das Fortschreiten der Abstammungslinie in Myelozyten abschwächt. Haematologica 100, 1285–1293 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xia, J. et al. Somatische Mutationen und klonale Hämatopoese bei angeborener Neutropenie. Blut 131, 408–416 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kandoth, C. et al. Mutationslandschaft und Bedeutung bei 12 großen Krebsarten. Natur 502, 333–339 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gerstung, M. et al. Die Evolutionsgeschichte von 2.658 Krebsarten. Natur 578, 122–128 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kuhn, E. et al. TP53-Mutationen bei serösem intraepithelialem Tubenkarzinom und gleichzeitigem hochgradigem serösem Beckenkarzinom – Hinweise, die die klonale Beziehung der beiden Läsionen stützen. J. Pathol. 226, 421–426 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Folkins, AK et al. Ein möglicher Vorläufer von serösem Beckenkrebs (p53-Signatur) und seine Prävalenz in Eierstöcken und Eileitern bei Frauen mit BRCA-Mutationen. Gynäkologie. Onkol. 109, 168–173 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fearon, ER & Vogelstein, B. Ein genetisches Modell für die kolorektale Tumorentstehung. Zelle 61, 759–767 (1990).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mercuri, A. et al. Immunphänotypische Analyse der Hämatopoese bei Patienten mit Shwachman-Bodian-Diamond-Syndrom. EUR. J. Hämatol. 95, 308–315 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bick, AG et al. Vererbte Ursachen der klonalen Hämatopoese in 97.691 gesamten Genomen. Natur 586, 763–768 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jaiswal, S. et al. Klonale Hämatopoese und Risiko einer atherosklerotischen Herz-Kreislauf-Erkrankung. N. engl. J. Med. 377, 111–121 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Grinfeld, J. et al. Klassifikation und personalisierte Prognose bei myeloproliferativen Neoplasien. N. engl. J. Med. 379, 1416–1430 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Myers, KC et al. Myelodysplastisches Syndrom und akute myeloische Leukämie bei Patienten mit Shwachman-Diamond-Syndrom: eine multizentrische, retrospektive Kohortenstudie. Lancet Hämatol. 7, e238–e246 (2020).

Artikel PubMed Google Scholar

Steele, CD et al. Signaturen von Kopienzahlveränderungen bei menschlichem Krebs. Natur 606, 984–991 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Light, N. et al. Keimbahn-TP53-Mutationen unterliegen bereits Jahre vor der Tumordiagnose einem Anstieg der Kopienzahl. Nat. Komm. 14, 77 (2023).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Abascal, F. et al. Somatische Mutationslandschaften mit Einzelmolekülauflösung. Natur 593, 405–410 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Watson, CJ et al. Die evolutionäre Dynamik und Fitnesslandschaft der klonalen Hämatopoese. Science 367, 1449–1454 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Machado, HE et al. Vielfältige Mutationslandschaften in menschlichen Lymphozyten. Natur 608, 724–732 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alexandrov, LB et al. Signaturen von Mutationsprozessen bei menschlichem Krebs. Natur 500, 415–421 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alexandrov, LB et al. Das Repertoire an Mutationssignaturen bei menschlichem Krebs. Natur 578, 94–101 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wong, CC, Traynor, D., Basse, N., Kay, RR & Warren, AJ Defekte Ribosomenassemblierung beim Shwachman-Diamond-Syndrom. Blut 118, 4305–4312 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

McKerrell, T. et al. Leukämie-assoziierte somatische Mutationen führen zu unterschiedlichen Mustern der altersbedingten klonalen Hämatopoese. Cell Rep. 10, 1239–1245 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jaiswal, S. et al. Altersbedingte klonale Hämatopoese ist mit unerwünschten Folgen verbunden. N. engl. J. Med. 371, 2488–2498 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

van Zeventer, IA et al. Evolutionslandschaft der klonalen Hämatopoese bei 3.359 Personen aus der Allgemeinbevölkerung. Krebszelle 41, 1017–1031.e4 (2023).

Artikel PubMed Google Scholar

Hecker, JS et al. CHIP und Hüften: Klonale Hämatopoese kommt häufig bei Patienten vor, die sich einer Hüftendoprothetik unterziehen, und ist mit einer Autoimmunerkrankung verbunden. Blut 138, 1727–1732 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mayerhofer, C. et al. Klonale Hämatopoese bei älteren Brustkrebspatientinnen unter Chemotherapie. J. Natl Cancer Inst. 115, 981–988 (2023).

Artikel PubMed Google Scholar

Cao, B. et al. Das durch Krebs mutierte Ribosomenprotein L22 (RPL22/eL22) unterdrückt das Überleben von Krebszellen, indem es den p53-MDM2-Schaltkreis blockiert. Oncotarget 8, 90651–90661 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Arzalluz-Luque, Á. et al. Mutantes PRPF8 verursacht weit verbreitete Spleißveränderungen in Spleißosomenkomponenten in iPSC-abgeleiteten RPE-Zellen von Retinitis pigmentosa-Patienten. Vorderseite. Neurosci. 15, 636969 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zemp, I. et al. CK1δ und CK1ε sind Bestandteile der Vorläufer der menschlichen 40S-Untereinheit, die für die zytoplasmatische 40S-Reifung erforderlich sind. J. Cell Sci. 127, 1242–1253 (2014).

CAS PubMed Google Scholar

Ameur, A., Kloosterman, WP & Hestand, MS Einzelmolekülsequenzierung: Auf dem Weg zu klinischen Anwendungen. Trends Biotechnologie. 37, 72–85 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bernard, E. et al. Molekulares internationales prognostisches Bewertungssystem für myelodysplastische Syndrome. NEJM Evid. 1, 1–14 (2022).

Lindsley, RC et al. Prognostische Mutationen beim myelodysplastischen Syndrom nach Stammzelltransplantation. N. engl. J. Med. 376, 536–547 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Papaemmanuil, E. et al. Genomische Klassifizierung und Prognose bei akuter myeloischer Leukämie. N. engl. J. Med. 374, 2209–2221 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gerstung, M. et al. Präzisionsonkologie bei akuter myeloischer Leukämie mithilfe eines Wissensbank-Ansatzes. Nat. Genet. 49, 332–340 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bernard, E. et al. Auswirkungen des TP53-Allelzustands auf die Genomstabilität, das klinische Erscheinungsbild und die Ergebnisse bei myelodysplastischen Syndromen. Nat. Med. 26, 1549–1556 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, H. Ausrichten von Sequenzlesevorgängen, Klonsequenzen und Assemblierungs-Contigs mit BWA-MEM. https://doi.org/10.48550/arXiv.1303.3997 (2013).

Li, H. & Durbin, R. Schnelle und genaue Ausrichtung kurzer Lesevorgänge mit der Burrows-Wheeler-Transformation. Bioinformatik 25, 1754–1760 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jones, D. et al. cgpCaVEManWrapper: Einfache Ausführung von CaVEMan zur Erkennung somatischer Einzelnukleotidvarianten in NGS-Daten. Curr. Protokoll. Bioinforma. 56, 15.10.1–15.10.18 (2016).

Artikel Google Scholar

Ellis, P. et al. Zuverlässiger Nachweis somatischer Mutationen in festen Geweben durch Laser-Mikrodissektion und DNA-Sequenzierung mit geringem Aufwand. Nat. Protokoll. 16, 841–871 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ye, K., Schulz, MH, Long, Q., Apweiler, R. & Ning, Z. Pindel: ein Musterwachstumsansatz zur Erkennung von Bruchpunkten großer Deletionen und mittelgroßer Einfügungen aus Paired-End-Short-Reads. Bioinformatik 25, 2865–2871 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Loo, PV et al. Allelspezifische Kopienzahlanalyse von Tumoren. PNAS 107, 16910–16915 (2010).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nik-Zainal, S. et al. Landschaft somatischer Mutationen in 560 Sequenzen des gesamten Brustkrebsgenoms. Natur 534, 47–54 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moore, L. et al. Die Mutationslandschaft des normalen menschlichen Endometriumepithels. Natur 580, 640–646 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Hoang, DT et al. MPBoot: Schnelle phylogenetische Maximum-Parsimony-Tree-Inferenz und Bootstrap-Approximation. BMC Evolution. Biol. 18, 11 (2018).

Artikel Google Scholar

Martincorena, I. et al. Universelle Selektionsmuster bei Krebs und somatischen Geweben. Zelle 171, 1029–1041.e21 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gori, K. & Baez-Ortega, A. Sigfit: flexible Bayes'sche Inferenz von Mutationssignaturen. bioRxiv 372896 https://doi.org/10.1101/372896 (2020).

Machado, HE Die konvergente somatische Evolution beginnt in der Gebärmutter in einer Keimbahn-Ribosomopathie. https://github.com/machadoheather/somatic_evolution_SDS, https://doi.org/10.5281/zenodo.8172028 (2023).

Machado, HE Die konvergente somatische Evolution beginnt in der Gebärmutter in einer Keimbahn-Ribosomopathie. https://github.com/nangalialab/ShwachmanDiamond, https://doi.org/10.5281/zenodo.8172581 (2023).

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JN wird durch ein Cancer Research UK Fellowship unterstützt und die Arbeit im JN-Labor wird vom Wellcome Trust, Cancer Research UK, Alborada Trust, Rosetrees Trust und der MPN Research Foundation unterstützt. Die Arbeit im DGK-Labor wird durch einen European Research Council Starting Grant (ERC-2016-STG-715371), die Bill and Melinda Gates Foundation (INV-002189 und INV-038816) und einen Cancer Research UK Program Foundation Award (DCRPGF\) unterstützt. 100008). AJW wurde von einem Blood Cancer UK Program Continuity Grant (21002 an AJW), dem UK Medical Research Council (MR/T012412/1), dem Kay Kendall Leukemia Fund, Rosetrees Trust, der SDS Foundation, dem Shwachman-Diamond Project und dem unterstützt Butterfly Guild, SDS UK, das Connor Wright Project, das Cambridge National Institute for Health Research Biomedical Research Centre und die European Cooperation in Science and Technology (COST) Action CA18233 „European Network for Innovative Diagnosis and Treatment of Chronic Neutropenias, EuNet INNOCHRON“ und CA21154, „Translationale Kontrolle im Krebs-Europäischen Netzwerk, TRANSLACORE“. Die Proben wurden von der Cambridge Blood and Stem Cell Biobank bereitgestellt, die vom Cambridge NIHR Biomedical Research Centre, dem Wellcome Trust-MRC Stem Cell Institute und dem Cambridge Experimental Cancer Medicine Centre, Großbritannien, unterstützt wird. Die Autoren möchten auch den Einzelpersonen für die Spende der Proben danken, die in dieser Studie verwendet wurden.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Heather E. Machado, Nina F. Øbro, Nicholas Williams, Shengjiang Tan.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: David G. Kent, Jyoti Nangalia, Alan J. Warren.

Wellcome Sanger Institute, Wellcome Genome Campus, Hinxton, Großbritannien

Heather E. Machado, Nicholas Williams, Emily Mitchell, Peter J. Campbell und Jyoti Nangalia

Willkommen MRC Cambridge Stem Cell Institute, Universität Cambridge, Cambridge, Großbritannien

Megan Davies, Miriam Belmonte, Emily Mitchell, Nicole Mende, Anna Clay, Elisa Laurenti, David G. Kent, Jyoti Nangalia und Alan J. Warren

Abteilung für Hämatologie, Universität Cambridge, Cambridge, Großbritannien

Nina F. Øbro, Shengjiang Tan, Ahmed Z. Boukerrou, Megan Davies, Miriam Belmonte, E. Joanna Baxter, Nicole Mende, Anna Clay, Elisa Laurenti, David G. Kent, Jyoti Nangalia und Alan J. Warren

Abteilung für klinische Immunologie, Universitätsklinikum Kopenhagen, Rigshospitalet, Kopenhagen, Dänemark

Nina F. Øbro

Cambridge Institute for Medical Research, Keith Peters Building, Cambridge, Großbritannien

Shengjiang Tan, Ahmed Z. Boukerrou und Alan J. Warren

Abteilung für Hämatologie, Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust, London, Großbritannien

Philip Ancliff & Jutta Köglmeier

University Hospitals Dorset NHS Foundation Trust, The Royal Bournemouth Hospital, Bournemouth, Großbritannien

Sally B. Killick

Abteilung für Hämatologische Medizin, King's College Hospital NHS Foundation Trust und King's College London, London, Großbritannien

Austin Kulasekararaj

Abteilung für Krebswissenschaften, School of Medical Sciences, Fakultät für Biologie, Medizin und Gesundheit, Universität Manchester, Manchester Cancer Research Centre, Wilmslow Road, Manchester, Großbritannien

Stefan Meyer

Abteilung für pädiatrische Hämatologie und Onkologie, Royal Manchester Children's Hospital, Manchester Foundation Trust, Manchester, Oxford Road, Manchester, Großbritannien

Stefan Meyer

Onkologie bei Teenagern und Jugendlichen, The Christie NHS Foundation Trust, Wilmslow Road, Manchester, Großbritannien

Stefan Meyer

York Biomedical Research Institute, Abteilung für Biologie, Universität York, York, Großbritannien

David G. Kent

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HEM und NW führten Genomanalysen durch; NFØ. entwickelte klonale Tests und führte phänotypische Analysen mit Unterstützung von MD, MB und AC durch; ST und AZB führten funktionelle eIF6-Assays durch; EJB, MD und AC unterstützten bei der Beispielgenerierung; EM, MD, AC, NM und EL teilten WGS-Daten von normalen Personen; PA, JK, SBK, AK, SM und AJW stellten Proben zur Verfügung; PJC, DGK, JN und AJW betreuten die Studie. HEM, JN, DGK und AJW haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit David G. Kent, Jyoti Nangalia oder Alan J. Warren.

AJW und ST sind Berater für SDS Therapeutics. PJC ist Mitbegründer und Anteilseigner von FL86 Inc. Die übrigen Autoren geben an, keine konkurrierenden Interessen zu haben.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Machado, HE, Øbro, NF, Williams, N. et al. Die konvergente somatische Evolution beginnt in utero in einer Keimbahn-Ribosomopathie. Nat Commun 14, 5092 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40896-5

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Eingegangen: 04. Oktober 2022

Angenommen: 14. August 2023

Veröffentlicht: 22. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40896-5

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