Seneszierende RANKL+-Zellen unter mechanischer Belastung: ein therapeutisches Ziel für die kieferorthopädische Wurzelresorption unter Verwendung von Senolytika

International Journal of Oral Science Band 15, Artikelnummer: 20 (2023) Diesen Artikel zitieren

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In der Zahnheilkunde ist die kieferorthopädische Wurzelresorption ein lang anhaltendes Problem ohne wirksame Behandlungsstrategie, und ihre Mechanismen, insbesondere diejenigen im Zusammenhang mit seneszenten Zellen, sind noch weitgehend unbekannt. Hier verwendeten wir ein kieferorthopädisches Intrusionszahnbewegungsmodell mit einer L-Schleife bei Ratten, um zu zeigen, dass durch mechanische Belastung induzierte seneszierende Zellen die apikale Wurzelresorption verschlimmern, was durch die Verabreichung von Senolytika (einem Cocktail aus Dasatinib und Quercetin) verhindert wurde. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Zementoblasten und parodontale Bandzellen ab dem dritten Tag eine zelluläre Seneszenz (p21+ oder p16+) durchliefen und den Rezeptoraktivator des Kernfaktors Kappa B (RANKL) stark exprimierten, was anschließend Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP)-positive Odontoklasten induzierte und provozierte apikale Wurzelresorption. Mehr seneszierende p21+-Zellen exprimierten RANKL als seneszierende p16+-Zellen. Wir beobachteten nur geringfügige Veränderungen in der Anzahl der nicht seneszenten RANKL+-Zellen, wohingegen die Anzahl der seneszenten RANKL+-Zellen ab dem siebten Tag deutlich zunahm. Interessanterweise fanden wir auch Cathepsin-K+p21+p16+-Zellen in der Wurzelresorptionsfossa, was auf alternde Odontoklasten schließen lässt. Die orale Verabreichung von Dasatinib und Quercetin reduzierte diese seneszenten Zellen und TRAP+-Zellen deutlich und linderte schließlich die Wurzelresorption. Insgesamt enthüllen diese Ergebnisse jene abweichenden Reize in kieferorthopädisch intrusiven Zahnbewegungen, die durch frühe seneszente RANKL+-Zellen hervorgerufen werden und eine entscheidende Rolle bei der Odontoklastogenese und der anschließenden Wurzelresorption spielen. Diese Erkenntnisse bieten ein neues therapeutisches Ziel zur Verhinderung der Wurzelresorption während kieferorthopädischer Zahnbewegungen.

Eine Resorption der apikalen Wurzel während einer kieferorthopädischen Behandlung ist für Kieferorthopäden häufig ein Problem. Beispielsweise wurde in einigen früheren Studien die Inzidenzrate der Wurzelresorption bei 90 % und 100 % erreicht.1 Darüber hinaus kommt es bei 12 % bis 17 % der kieferorthopädischen Patienten zu einer mittelschweren bis schweren apikalen Wurzelresorption, was gelegentlich zu unbeabsichtigten klinischen Nebenwirkungen führt , Zahnverlust.2 Dennoch gibt es derzeit keine wirksamen vorbeugenden Therapien. Daher ist die Erforschung der verschleierten therapeutischen Ziele auf der Grundlage neuartiger Mechanismen erforderlich.

Die Wurzelresorption ist ein komplexer Mechanismus, der einem Orchester unphysiologischer Zellaktivierung und Mobilisierung zahlreicher Zellen zugrunde liegt.3 Ähnlich wie Osteoklasten, die mit der Knochenresorption einhergehen, entstehen Odontoklasten, um Wurzeloberflächen zu resorbieren.4,5 Der Rezeptoraktivator des Kernfaktors Kappa B Der Ligand (RANKL)/RANK-bezogene Weg ist einer der klassischen Wege, der die Induktion und Aktivierung von Odontoklasten und Osteoklastogenese kräftig fördert.3 Verschiedene Zelltypen, wie z. B. Zementoblasten und parodontale Ligamentzellen (PDL), exprimieren diesen Liganden.6,7 Darüber hinaus erleichtern mehrere Stressfaktoren die RANKL-Expression, darunter Entzündungen, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und nicht-physiologischer mechanischer Stress.8,9 Beispielsweise exprimieren eine menschliche immortalisierte Zementoblastenzelllinie und PDL-Zellen RANKL unter Stress signifikant;10,11 ,12,13,14 Kieferorthopädische Zahnbewegungen (OTM) aktivieren Zementoblasten, um die RANKL-Expression zu induzieren.15,16 Angesichts der Ähnlichkeiten zwischen Osteoklastogenese und Odontoklastogenese17 sind Osteoporosemedikamente (z. B. Bisphosphat, das den direkten Zelltod verursacht, und Denosumab, ein Anti-RANKL-Antikörper, die die Bildung von Osteoklasten verhindern) wurden ausschließlich zur Behandlung von Wurzelresorptionen untersucht.18,19 Bisher haben diese Medikamente jedoch noch keine klinische Anwendung erreicht.

Bei gealterten Zellen ist zelluläre Seneszenz unvermeidbar, was zu einem irreversiblen Proliferationsstopp, starken mitogenen Signalen, verkürzten Telomeren, DNA-Schäden und erhöhten ROS in vitro und in vivo führt.20,21 Insbesondere DNA-Schäden spielen eine entscheidende Rolle bei stressbedingten Frühgeborenen Seneszenz, hervorgerufen durch verschiedene Stressfaktoren wie mechanische, oxidative, Strahlung und genotoxische Mittel.22,23,24,25 Selbst in der Zahnmedizin wurde über Ethanol-induzierte zelluläre Seneszenz bei Zementoblasten und parodontalen Bandzellen berichtet.26 Auch andere Forscher haben berichtet zeigten, dass Zementoblasten als Reaktion auf mechanische Stressreize eine zelluläre Seneszenz- und Verkalkungshemmung erfahren.27 Seneszierende Zellen aktivieren im Allgemeinen Transkriptionsfaktorkaskaden wie p53/p21CIP1, einen Signalweg, der an der Unterdrückung des Zellzyklus beteiligt ist, und p16INK4A/RB.28,29 Daher p21 und p16 sind häufig verwendete Marker zum Nachweis seneszenter Zellen.30,31 Darüber hinaus haben schnelle Fortschritte in zellulären Seneszenzstudien gezeigt, dass seneszente Zellen an verschiedenen altersbedingten Krankheiten beteiligt sind und die Lebensdauer beeinflussen, indem sie seneszenzassoziierte sekretorische Phänotypen, einschließlich entzündlicher Substanzen, sezernieren32 die das umliegende Gewebe beeinträchtigen.33

Im Jahr 2015 wurde ein Arzneimittelcocktail bestehend aus Dasatinib (Tyrosinkinaseinhibitor; zur Behandlung chronischer myeloischer Leukämie) und Quercetin (ein pflanzliches Flavonoid) als spezifischer Zelltod-auslösender Wirkstoff (d. h. Senolytikum) für alternde Zellen identifiziert (im Folgenden Dasatinib und Quercetin [D + Q]).34 Seitdem wurde seine Wirksamkeit bei verschiedenen Krankheiten wie Diabetes, Alzheimer-Krankheit35 und Osteoporose36 sowie zur Wiederherstellung der Knochenregeneration bestätigt.37 Klinische Machbarkeitsstudien und die Entwicklung Die Entwicklung anderer Senolytika schreitet kontinuierlich voran.38,39 Folglich gelten seneszierende Zellen mittlerweile als therapeutische Ziele für verschiedene Krankheiten.20 Daher sind seneszierende Zellen ein potenzielles therapeutisches Ziel zur Verhinderung der Wurzelresorption. Dennoch ist wenig über die Assoziation und Lokalisierung seneszenter Zellen unter OTM und ihre Funktion bei der Wurzelresorption bekannt.

Hier zeigen wir, dass schädlicher mechanischer Stress durch OTM RANKL-positive (RANKL+) seneszierende Zementoblasten und PDL-Zellen induziert und die Wurzelresorption in Rattenmolaren verschlimmert, indem wir ein kieferorthopädisches intrusives Zahnbewegungsmodell mit einer L-Schleife verwenden. Darüber hinaus haben wir bestätigt, dass die orale Verabreichung von D + Q die Anzahl der seneszenten RANKL+-Zellen deutlich reduziert und die Wurzelresorption abschwächt, was darauf hindeutet, dass durch mechanischen Stress verursachte seneszierende Zellen ein potenzielles Ziel für eine Wurzelresorptionstherapie sind.

Um die apikale Wurzelresorption nachzuahmen, haben wir zunächst ein Ratten-OTM-Modell mit einer vertikal nach unten gerichteten L-Schleife erstellt, wie in den Abbildungen gezeigt. 1a, b. Eine L-Schleife ist ein herkömmliches Gerät, das in der kieferorthopädischen Behandlung verwendet wird und die gewünschten Kräfte und Momente erzeugt, um die Zähne vorhersehbar zu bewegen. Folglich breitet sich die Kraft als mechanische Belastung direkt auf den Apex und das PDL-Gewebe aus. Die oberen linken ersten Molaren (M1) wurden 14 Tage lang kontinuierlich einer mechanischen Kraft (5 N) vertikal nach unten ausgesetzt (Abb. 1c, d). Als Kontrollgruppe dienten Ratten ohne L-Loop-Behandlung (Abb. 1c, Abb. S1). Die Mikrocomputertomographie (µ-CT)-Analyse zeigte nach 14 Tagen keine Zahnbewegung in der Kontrollgruppe (Abb. S1a), während sich die M1 nach dem 5. Tag mit der L-Schleife deutlich vertikal nach unten bewegten, was darauf hindeutet, dass OTM erfolgreich mechanische Kraft erzeugte und Belastung des periapikalen Gewebes (Abb. 1d, e).

Das kieferorthopädische Zahnintrusionsmodell bei Ratten. a Ein schematisches Diagramm des L-Loop-Kraftsystems am Modell der kieferorthopädischen Zahnbewegung (OTM). Horizontale blaue Linien: L-Loop-Beine im inaktivierten Stadium. Nachdem den L-Schlaufenbeinen mithilfe von Harz eine vertikale Kraft (5 N: roter Pfeil) hinzugefügt wurde, wird der linke M1 über Hebelwirkungen (rote Kreise) der vertikalen Kraft (grüner Pfeil) ausgesetzt. M1: erster Molar, M2: zweiter Molar, M3: dritter Molar. b Makroskopische Bilder des Modells mit der L-Schleife von der bukkalen (links) und frontalen Seite (geringe und hohe Vergrößerung: mittlere bzw. rechte Bilder). c Ein Ablaufdiagramm für Tierversuche (n = 4 pro Gruppe). D Dasatinib, Q Quercetin. d Rekonstruierte mikrocomputertomographische (μ-CT) Bilder der linken Oberkiefermolaren. Weiße Linien: die Basislinie zur Messung der OTM-Distanz von M1. Gelber Zwei-Wege-Pfeil: der Abstand vom Scheitelpunkt von M1 zur Grundlinie. e Eine quantitative Analyse des OTM-Abstands von (d), dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichungen. ****P < 0,000 1; ns nicht signifikant

Um anschließend zu untersuchen, ob das OTM-Modell eine Wurzelresorption verursachen könnte, untersuchten wir die Spitze der mesialen Wurzel des M1 mithilfe von µ-CT und histologischer Färbung, einschließlich Tartrat-resistenter saurer Phosphatase (TRAP)-Färbung zur Erkennung von Odontoklasten. Hochauflösende μ-CT- und dreidimensionale (3D) Rekonstruktionsbilder zeigten, dass sich die Morphologie der apikalen Wurzeloberfläche zeitabhängig veränderte und unter Belastung unregelmäßig wurde (Abb. 2a). Darüber hinaus zeigte die quantitative µ-CT-Analyse, dass die mittlere apikale Wurzelmineraldichte (RMD) ab Stresstag 5 signifikant abnahm (Abb. 2c). Die TRAP-Färbung identifizierte keine Odontoklasten (dh TRAP+-Zellen) in der Kontrollgruppe (Abb. S1b). In der OTM-Gruppe traten jedoch ab dem dritten Stresstag Odontoklasten auf der Wurzeloberfläche auf, wenn auch in geringer Zahl (Abb. 2b, schwarze Pfeile). Im Gegensatz dazu traten ab dem 3. Stresstag mehr Osteoklasten (TRAP+-Zellen: Abb. 2b, e, schwarze Pfeilspitzen) auf der Alveolarknochenoberfläche auf. Ab dem 5. Stresstag nahmen die Odontoklasten rasch zu, was mit dem Beginn der Wurzelresorption zusammenfiel (Abb. 2b, d). ). Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbungsbilder zeigten, dass an der Spitze vom Stresstag 7 bis 14 eine starke Wurzelresorption auftrat (Abb. 2b, weiße Pfeilspitzen).

Apikale Wurzelresorption in den Zähnen von Ratten unter mechanischer Belastung. ein μ-CT und dreidimensionale Rekonstruktionsbilder der mesialen Wurzelspitze des linken ersten Oberkiefermolaren. b Mesiale Wurzelbilder der Tartrat-resistenten sauren Phosphatase (TRAP) und Hämatoxylin-Eosin-Färbung nach mechanischer Belastung. Schwarze Pfeile: TRAP+ Odontoklastenzellen. Schwarze Pfeilspitzen: TRAP+-Osteoklasten. Ab Alveolarknochen. Weiße Pfeilspitzen: Wurzelresorptionsgrube. c Wurzelmineraldichte (RMD) der mesialen Wurzelspitze. d TRAP+-Odontoklastenzahlen auf den Wurzeloberflächen. e TRAP+-Osteoklastzahlen auf der Alveolarknochenoberfläche. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt. **P < 0,01, ***P < 0,001, ns nicht signifikant. Maßstabsbalken: 100 μm für (a) und 250 μm für (b). Keine Nummer

Die Stimulation durch mechanischen Stress induziert die zelluläre Seneszenz von Zementoblasten und PDL-Zellen26,27 und reguliert die RANKL-Expression hoch,40,41,42 was möglicherweise mit der Wurzelresorption verbunden ist. Daher haben wir die Lokalisierung von CAP-positiven Zellen (Cementum Attachment Protein), die Seneszenzmarker (p21 und p16) und RANKL exprimieren, mithilfe von Immunfluoreszenzfärbung überprüft (Abb. 3a, 4a und S2a). Darüber hinaus bestätigten wir mithilfe von Ki-67 (einem bekannten Proliferationsmarker) und TUNEL-Färbung (verwendbar zum Nachweis von DNA-Schäden und Apoptose) die zelluläre Seneszenz und DNA-Schäden (Abb. S3 und S4). Zementoblasten und PDL-Zellen sezernieren CAP; daher wurde CAP verwendet, um sie zu identifizieren.43,44,45,46 Im Folgenden definieren wir CAP+-Zellen auf der Wurzeloberfläche als Zementoblasten und CAP+-Zellen in PDL als PDL-Zellen.

RANKL+-Zellen und p21+-seneszierende Zellen in periapikalen Geweben unter mechanischer Belastung. a Immunfluoreszenzfärbung und Co-Lokalisierung des Zementanhaftungsproteins (CAP) und des Rezeptoraktivators des Kernfaktor-Kappa-Β-Liganden (RANKL) mit p21 unter dem 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), Gegenfärbung in periapikalen Geweben danach mechanische Beanspruchung anwenden. Kern: blau (DAPI); Kappe: grün; RANKL: weiß; S. 21: rot. Maßstabsbalken: 100 und 25 μm für niedrige bzw. hohe Vergrößerung. Weiße Pfeile und die orangefarbene gestrichelte Linie in (a) zeigen den Bereich der Wurzelresorptionsgrube an. PDL-Parodontalband. a1 Fluoreszenzreaktive Zellen in der Wurzelresorptionsgrube. Maßstabsbalken: 10 μm

RANKL+-Zellen und p16+-seneszierende Zellen in periapikalen Geweben unter mechanischer Belastung. a Immunfluoreszenzfärbung und Co-Lokalisierung von Zementanhaftungsprotein (CAP) und RANKL mit p16 unter der DAPI-Gegenfärbung in periapikalen Geweben nach Anwendung mechanischer Belastung. Kern: blau (DAPI); Kappe: grün; RANKL: weiß; S. 16: rot. Maßstabsbalken: 100 und 25 μm für niedrige bzw. hohe Vergrößerung. Weiße Pfeile und die orangefarbene gestrichelte Linie in (a) zeigen den Bereich der Wurzelresorptionsgrube an. PDL-Parodontalband. a1 Fluoreszenzreaktive Zellen in der Wurzelresorptionsgrube. Maßstabsbalken: 10 μm

Die Abbildungen 3 bis 5 sowie die Abbildungen S1c und S2a zeigen die räumlich-zeitlichen Verteilungen von Zellen, die CAP, RANKL, p21 oder p16 in den periapikalen Geweben exprimieren, sowie die quantifizierten Zahlen. In der Kontrollgruppe wurden nach 14 Tagen ohne OTM keine Zementoblasten und PDL-Zellen beobachtet, die RANKL oder p21 exprimierten (Abb. S1c). Im Gegensatz dazu traten RANKL+-, p21+- und p16+-Zellen in den periapikalen Geweben unter mechanischer Belastung auf (Abb. 3, 4 und Abb. S2a). Die Anzahl der proliferativen Zellen nahm parallel zum Anstieg der p21-Marker ab (Abb. S3), wohingegen die DNA-geschädigten Zellen (TUNEL+-Zellen) unter der mechanischen Belastung zunahmen (Abb. S4). RANKL+-Zementoblasten und RANKL+-PDL-Zellen (d. h. RANKL+CAP+) traten ab dem Stresstag 3 auf und nahmen an den Stresstagen 5 und 7 deutlich zu (Abb. 5a). In ähnlicher Weise nahmen seneszierende Zementoblasten und PDL-Zellen (p21+CAP+- oder p16+CAP+-Zellen) vom Stresstag 3 bis 7 zu (Abb. 5b, c). Obwohl wir die absoluten Zahlen von p21+- und p16+-Zellen aufgrund unterschiedlicher Abschnitte nicht direkt vergleichen konnten, können wir aufgrund des statistischen Unterschieds pro Abschnitt schlussfolgern, dass die Anzahl der p21+-Zellen früher zunahm als die der p16+-Zellen. Unter diesen seneszenten Zellen fanden wir RANKL+-Zementoblasten und PDL-Zellen im periapikalen Gewebe (Abb. 3 und 4). Die Abbildungen 3a1 und 4a1 zeigen repräsentative RANKL+ seneszierende Zementoblasten in der Wurzelresorptionsgrube.

Analysierte den Anteil seneszierender (p21+ oder p16+)- oder RANKL+-Zementoblasten und PDLs in periapikalen Geweben. a Die Anzahl der RANKL+-Zementoblasten oder RANKL+-PDL-Zellen im periapikalen Gewebe. Zementoblasten: CAP+-Zellen auf der Wurzeloberfläche; PDL-Zellen: CAP+-Zellen in PDL. b, c Die Anzahl der p21+- oder p16+-Zementoblasten oder PDL-Zellen im periapikalen Gewebe. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,000 1, ns nicht signifikant. Keine Nummer

Um den Charakter der Zementoblasten oder PDL-Zellen (CAP+-Zellen) unter mechanischer Belastung zu untersuchen, haben wir jede Zelle anhand der Seneszenzmarkerexpression (p21 und p16) und RANKL weiter klassifiziert (Abb. 6 und 7 für Zementoblasten bzw. PDL-Zellen). In den seneszenten Zementoblasten (p21+ oder p16+; gestrichelte rote Kreise in Abb. 6a – c) nahmen die RANKL+-Zellen im Laufe der Zeit bis zum Stresstag 7 zu, wohingegen RANKL–-Zellen nur geringfügige Veränderungen aufwiesen (Abb. 6b, c); Diese Ergebnisse legen nahe, dass die meisten seneszenten Zementoblasten RANKL exprimierten. In seneszenten PDL-Zellen (p21+ oder p16+; gestrichelte rote Kreise in Abb. 7a – c) nahmen die seneszenten RANKL+- und RANKL–-Zellen bis zum 7. Stresstag ebenfalls zu. Obwohl wir die Gründe für die oben genannten Unterschiede nicht klären konnten, sind diese Ergebnisse zeigen, dass seneszierende Zementoblasten und PDL-Zellen RANKL als Reaktion auf mechanische Belastung im periapikalen Gewebe empfindlich exprimieren.

Klassifizierung von RANKL+ oder seneszenten Zementoblasten in periapikalen Geweben unter kieferorthopädischer Zahnbewegung (d. h. mechanischer Belastung). a Schematische Darstellung von RANKL+ oder seneszenten Zementoblasten unter mechanischer Belastung. Rote gestrichelte Kreise: seneszierende Zellen, die RANKL aus (b) und (c) exprimieren oder nicht exprimieren. Blaue gestrichelte Kreise: RANKL+-Zellen, die Seneszenzmarker (p21 oder p16) aus (d) und (e) exprimieren oder nicht exprimieren. b, c RANKL-Expression in seneszenten Zementoblasten (p21+/CAP+/DAPI oder p16+/CAP+/DAPI). d, e Seneszenzmarker-Expression (p21 oder p16) in RANKL+-Zementoblasten (RANKL+/CAP+/DAPI). Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,000 1, ns nicht signifikant. Keine Nummer

Klassifizierung von RANKL+ oder seneszenten PDL-Zellen in periapikalen Geweben unter kieferorthopädischer Zahnbewegung (d. h. mechanischer Belastung). a Schematische Darstellung von RANKL+- oder seneszenten PDL-Zellen unter mechanischer Belastung. Rote gestrichelte Kreise: seneszierende Zellen, die RANKL aus (b) und (c) exprimieren oder nicht exprimieren. Blaue gestrichelte Kreise: RANKL+-Zellen, die Seneszenzmarker (p21 oder p16) aus (d) und (e) exprimieren oder nicht exprimieren. b, c RANKL-Expression in seneszenten PDL-Zellen (p21+/CAP+/DAPI oder p16+/CAP+/DAPI). d, e Seneszenzmarker-Expression (p21 oder p16) in RANKL+ PDL-Zellen (RANKL+/CAP+/DAPI). Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt. **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,000 1, ns nicht signifikant. Keine Nummer

Als nächstes analysierten wir den Anteil seneszierender (p21+ oder p16+) Zellen in RANKL+-Zementoblasten (gestrichelte blaue Kreise in Abb. 6a, d, e). Die Anzahl der p21–- und p21+-Zellen unterschied sich bis zum 5. Stresstag nicht, dann nahmen die p21+-Zellen ab dem 7. Stresstag deutlich zu (Abb. 6d). Unterdessen war die Anzahl der p16+-Zellen bis zum 14. Stresstag durchweg geringer als die Anzahl der p16–-Zellen. Bemerkenswert ist, dass p21–-Zellen nicht-seneszierende Zellen darstellen, da p21 bekanntermaßen ein früher Seneszenzmacher ist.47 Bei p16–-Zellen ist dies jedoch der Fall nicht immer nicht seneszente Zellen, da sie auch früh seneszierende p21+-Zellen umfassen; Die Expression von p21 und p16 überschneidet sich bei später Seneszenz.47 Die Neigung seneszenter PDL-Zellen unter mechanischer Belastung steht im Einklang mit dem Ergebnis seneszierender Zementoblasten (Abb. 7d, e). Insgesamt wurde RANKL hauptsächlich in seneszenten p21+-Zellen und nicht in nicht-seneszierenden Zellen und p16+-Zellen exprimiert.

Um zu testen, ob der Odontoklast eine zelluläre Seneszenz durchlief, färbten wir die Abschnitte des periapikalen Gewebes mit einem Antikörper für einen Odontoklastenmarker (Cathepsin K) mit Seneszenzmarkern (p21 und p16). Interessanterweise fanden wir mehrkernige Cathepsin-K+p21+p16+-Zellen in der Wurzelresorptionsgrube (Abb. 8 und S2b), jedoch nicht in stressfreien Gruppen am 14. Tag (Abb. S5).

Alternde Odontoklasten an der Wurzelresorptionsgrube. Immunfluoreszenzbilder der mit Cathepsin K, p21, p16 und DAPI gefärbten Wurzelresorptionsstellen nach 14 Tagen mechanischer Belastung. Kern: blau (DAPI); Cathepsin K: weiß; S. 21: rot; S. 16: grün. Maßstabsbalken = 100 μm und 25 μm für niedrige bzw. hohe Vergrößerung. Weiße Pfeile und die orange gestrichelte Linie zeigen den Wurzelresorptionsbereich an. Ab Alveolarknochen

Um die Funktion von RANKL+ seneszierenden Zementoblasten und PDL-Zellen für die Zahnwurzelresorption zu klären, verabreichten wir den Ratten unter mechanischer Belastung an den Tagen 1 und 7 oral ein Senolytikum (D + Q) (Abb. 1c). Die senolytische Dosis wurde aus früheren Studien definiert.48 Die Anzahl der seneszenten RANKL+-Zellen (p21+ oder p16+) und der Cathepsin-K+p21+p16+-Zellen nahm in der D + Q-Gruppe (Abb. 9a, b und S6) von der Wurzeloberfläche aus signifikant ab; Die Anzahl der Ki67+-Zellen (Proliferationszellen) wurde wiederhergestellt, während die Anzahl der TUNEL+-Zellen (apoptotische Zellen) zunahm (Abb. S3 und S4). Auch die Gesamtzahl der Zementoblasten und PDL-Zellen nahm in den periapikalen Geweben ab (Abb. 9c). Darüber hinaus nahmen die TRAP+-Zellen und die mehrkernigen Cathepsin-K+p21+p16+-Zellen von der Wurzeloberfläche aus signifikant ab (Abb. 9d, f und S6). Wir identifizierten jedoch immer noch TRAP+- und Cathepsin-K+-Zellen (aber keine p21+p16+)-Zellen auf dem Alveolarknochen (Abb. 9d und S6), obwohl die seneszenten Zellen verringert waren (Abb. S6) und an einigen Stellen kolokalisiert waren in der Nähe von Osteoklasten unter mechanischer Belastung (Abb. S7). Hochauflösende µ-CT-Bilder mit 3D-Rekonstruktion und quantitativen Analysen ergaben, dass die Wurzeln bei Verabreichung von D + Q eine glattere Oberfläche aufwiesen als ohne D + Q. Der RMD des proximalen apikalen Teils war in der D + Q-Gruppe höher als in der Gruppe ohne D + Q (Abb. 9e, f). Die Zahnbewegung nach der D + Q-Gabe verringerte sich auf etwa 50 % (Abb. 10). Das Ergebnis zeigt, dass die orale Verabreichung von Senolytika die unter mechanischer Belastung auftretende Wurzelresorption wirksam abschwächt, indem die seneszierenden RANKL+-Zellen eliminiert werden (Abb. 11), wobei weitere detaillierte Aufklärung und vorsichtige Verbesserungen erforderlich sind, um diese Therapie für den klinischen Einsatz voranzutreiben.

Die orale Verabreichung von Senolytika verhinderte die Wurzelresorption. Die Ratten wurden mit Dasatinib (D) + Quercetin (Q) behandelt oder am Tag 1 und 7 während kieferorthopädischer Zahnbewegungen (d. h. mechanischer Belastung) 14 Tage lang unbehandelt gelassen. a Immunfluoreszenzbilder der periapikalen Gewebe, gefärbt mit CAP, RANKL, p21, p16 und DAPI. Kern: blau (DAPI), RANKL: weiß; Kappe: grün; S. 21 oder S. 16: rot. Maßstabsbalken = 100 μm und 25 μm für niedrige bzw. hohe Vergrößerung. b Die Anzahl der RANKL+p21+-Zementoblasten und PDL-Zellen oder RANKL+p16+-Zementoblasten und PDL-Zellen in den periapikalen Geweben. c Zementoblasten und PDL-Zellen (CAP+-Zellen) im periapikalen Gewebe. d TRAP-Färbung und μ-CT-Bilder der mesialen Wurzelspitze. Maßstabsbalken: 100 μm für μ-CT-Bilder und 250 μm für TRAP-Färbung. e Dreidimensionale Rekonstruktionsbilder der mesialen Wurzelspitze des linken ersten Oberkiefermolaren. f Die Anzahl der TRAP+-Zellen an den Spitzen und die Wurzelmineraldichte (RMD) der mesialen Wurzelspitzen. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt. *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,000 1. Keine Zahl

Zahnbewegung mit oder ohne Verabreichung von D + Q am Tag 14. Die Ratten wurden am Tag 1 und 7 während kieferorthopädischer Zahnbewegungen (dh mechanischer Belastung) 14 Tage lang mit D + Q behandelt oder unbehandelt (Abb. 1c). a Rekonstruierte μ-CT-Bilder der linken Oberkiefermolaren. Weiße Linien: die Basislinie zur Messung der OTM-Distanz von M1. Gelber Zwei-Wege-Pfeil: der Abstand vom Scheitelpunkt von M1 zur Grundlinie. Maßstabsleiste: 1 mm. b Eine quantitative Analyse der OTM-Distanz. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt. ****P < 0,000 1

Schematische Darstellung zur Verhinderung der Wurzelresorption mit Dasatinib und Quercetin nach kieferorthopädischen Zahnbewegungen

Mit OTM fanden wir seneszierende RANKL+-Zellen und TRAP+-Odontoklasten um die apikale Wurzel. Die wiederholte orale Verabreichung von D + Q verringerte die Anzahl dieser Zellen und schwächte die Wurzelresorption deutlich ab. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die durch mechanischen Stress verursachte Seneszenz eine entscheidende Rolle bei der Wurzelresorption spielt, die mit Senolytika verhindert werden kann.

In dieser Studie haben wir mithilfe einer L-Schleife erfolgreich vertikale Kräfte und mechanische Belastung auf die linken Oberkiefer-M1s von Ratten induziert (Abb. 1). OTMs wurden in zahlreichen Studien mit mehreren Versuchsmodellen nachgeahmt, wie zum Beispiel mit horizontalen Zahnbewegungsmodellen unter Verwendung von elastischen Ketten,49 Federn mit geschlossener Spirale50 und Quad-Helix-Geräten51 und anderen.52 Diese Versuchsmodelle haben jedoch hauptsächlich induzierte Auswirkungen horizontale Zahnbewegung. Mittlerweile haben nur wenige Studien versucht, ein Intrusionszahnbewegungsmodell zu entwickeln, um eine Wurzelresorption in den Wurzelspitzen zu induzieren,52,53 obwohl bei kieferorthopädischen Behandlungen häufig vertikale Zahnbewegungen zum Einsatz kommen, die eine Intrusionskraft erzeugen. Bei der vertikalen Zahnbewegung sind die apikale Wurzel und das Parodontalgewebe hohen mechanischen Belastungen ausgesetzt, was das Risiko einer Wurzelresorption erhöht54,55 Nach einer vorübergehenden Wurzelresorption und anschließender Zementrestaurierung56 flacht die Wurzelspitze allmählich ab und erreicht ihre Länge nicht vollständig wieder.57 Als a Infolgedessen ist die apikale Wurzelresorption schwerwiegender als die laterale Wurzelresorption.58 Folglich haben wir ein Intrusionszahnbewegungsmodell erstellt, das sich als wertvolle Plattform für die Aufklärung der Mechanismen erwies, die der apikalen Wurzelresorption zugrunde liegen. Unser vorbereitetes Modell benötigt nur Edelstahldraht und lässt sich einfach mit den Schlaufen an den Zähnen befestigen. Unterdessen erfordert die Vorbereitung der L-Schleifenform kieferorthopädische Fähigkeiten.

Unsere µ-CT- und histologischen Analysen zeigten, dass eine schwere apikale Wurzelresorption um den Stresstag 5 herum einsetzte (Abb. 2a, b). Interessanterweise verzögerte sich die apikale Wurzelresorption gegenüber der Knochenresorption mit OTM (Abb. 2a). Darüber hinaus begannen am Stresstag 3 mehr TRAP+-Osteoklasten als TRAP+-Odontoklasten am Alveolarknochen aufzutreten (Abb. 2b, d, e). Obwohl verschiedene Forscher Odontoklasten und Osteoklasten in vivo und in vitro untersucht haben,59 bleibt der Unterschied in der Bildung dieser beiden Zelltypen in vivo völlig unklar. Frühere Studien haben berichtet, dass mechanisch stimulierte Zementoblasten weniger RANKL exprimieren als Osteoblasten10 und die Anfälligkeit für mechanische Stimulation bei Zementoblasten und Osteozyten unterschiedlich ist.60 Darüber hinaus ist die Entfernung vom Knochenmark, wo sich Monozyten (der Ursprung von Odontoklasten und Osteoklasten) befinden würden, könnte teilweise mit der Zeitverzögerung zwischen der apikalen Wurzelresorption und der Knochenresorption zusammenhängen.

Obwohl p21 und p16 signifikante seneszenzbezogene Marker sind, unterscheiden sich ihre Expressionskinetiken.61 In unserer Studie erschienen p21+-Zellen früher als p16+-Zellen in den periapikalen Geweben, die vertikaler mechanischer Belastung ausgesetzt waren (Abb. 3, 4 und 5). Frühere Studien haben berichtet, dass die Zunahme der p21-Expression bei Erreichen der zellulären Seneszenz drastisch abnahm, wohingegen die von p16 eine Zeit lang anhielt und dann am Ende der zellulären Lebensspanne und zu Beginn der Differenzierung zunahm.47 Daher haben einige kürzlich vorgeschlagen, dass p21 ist ein früher Seneszenzmarker und p16 ist ein später Seneszenzmarker.47 Darüber hinaus deuten neuere Berichte darauf hin, dass durch mechanischen Stress stimulierte Zementoblasten lincRNA-p21 exprimieren,27 ein kritischer Faktor, der Apoptose und Zellproliferation reguliert, indem er die Translation von Zielgenen durch unterdrückt p53-Signalweg62 (der Hauptweg, der die p21-Expression reguliert61). Angesichts der Tatsache, dass p21 in unserer Studie ab Tag 3 durchweg stärker exprimiert wurde als p16, liefern unsere Daten Hinweise darauf, dass OTM-induzierter mechanischer Stress auch in vivo seneszierende Zellen in der Größenordnung von p21 bis p16 hervorbringt (Abb. 5).

Frühere Studien haben gezeigt, dass Zementoblasten und PDL-Zellen unter mechanischen Stressreizen in vitro möglicherweise RANKL produzieren.12,16 Eine hohe RANKL-Expression fördert die Umwandlung von Zellen der Monozyten-Makrophagen-Linie in Präodontoklasten und erhöht die Wurzelresorptionsaktivität.3 In unserer Studie wurde die Die Anzahl der nicht seneszenten RANKL+-Zellen (p21–) und der seneszenten RANKL+-Zellen (p21+) unterschied sich bis zum 5. Stresstag nicht, wir beobachteten jedoch deutliche Unterschiede ab dem 7. Stresstag (Abb. 6d, 7d). Diese Ergebnisse legen nahe, dass RANKL+ nicht-seneszierende und RANKL+-seneszierende Zellen zur Einleitung der Odontoklastogenese beitragen. Letzteres spielt jedoch möglicherweise eine wesentliche Rolle bei der Verschlimmerung oder Reifung dieser Formation. Tatsächlich haben wir die meisten TRAP- und Cathepsin K+-Odontoklasten eliminiert, indem wir seneszente Zellen mithilfe von Senolytika (D + Q) entfernt haben (Abb. 9d, f und S6).

Die Verabreichung von D + Q reduzierte die Anzahl der RANKL+-, p21+- und/oder p16+-Zellen signifikant, was zu einer Hemmung der Wurzelresorption führte (Abb. 9a–f). Es ist bekannt, dass Dasatinib die RANKL-Expression in Stromazellen des Knochenmarks63 und die Osteoklastenbildung hemmt;64,65 Das Medikament könnte die RANKL-Expression aus seneszierenden Zementoblasten und die PDL- und Odontoklastenbildung aus Präodontoklasten direkt hemmen. Unterdessen haben frühere Studien gezeigt, dass mechanische Stimulation die Sekretion von ROS66 und entzündlichen Zytokinen durch Zellen fördert.67 Diese parakrinen Faktoren können DNA-Schäden verursachen und zelluläre Seneszenz induzieren.68 Darüber hinaus aktivieren Zellen der Monozyten-Makrophagen-Abstammungslinie, die exogenen ROS ausgesetzt sind, die RANKL-Signalkaskade. was zur Osteoklastenbildung führt.69 Im Gegensatz dazu hat Quercetin, eine D + Q-Komponente, antioxidative und entzündungshemmende Wirkung.38 Daher kann die D + Q-Behandlung die nicht alternden Zellen unterdrücken, um entzündliche Substanzen oder ROS zu produzieren, was dies verhindern kann Induktion seneszierender Zellen und Aktivierung des RANKL-Signals, ohne dass es zum Zelltod kommt. Allerdings verabreichten wir D + Q an den Stresstagen 1 und 7, und die Gesamtzahl der CAP+-Zellen in den periapikalen Geweben nahm auch am Stresstag 14 ab (Abb. 9c); Die TUNEL+-Zellen nahmen am 8. Tag zu (Abb. S4). Daher gehen wir davon aus, dass D + Q verschiedene Funktionen hatte: Beeinträchtigung der Induktion der Zellalterung in der frühen Phase, Verursachung des Zelltods der seneszierenden RANKL+-Zellen und Behinderung der Odontoklastenbildung aus Präodontoklasten, wodurch die Wurzelresorption in der Spätphase verhindert wird.

Frühere Studien haben berichtet, dass die RANKL-Stimulation die p21-Expression während der Osteoklastenbildung verursacht.70 Daher können wir nicht schließen, ob Odontoklasten nur aufgrund der p21-Expression eine zelluläre Seneszenz erfahren. In dieser Studie fanden wir jedoch eine begrenzte Anzahl mehrkerniger Cathepsin-K+p21+p16+-Zellen in der Wurzelresorptionsfossa (Abb. 8), was darauf hindeutet, dass die alternden Odontoklasten unter mechanischer Stressstimulation existieren. Obwohl die funktionellen Unterschiede zwischen seneszenten Odontoklasten-ähnlichen Zellen und anderen Odontoklasten derzeit nicht bekannt sind, konnten sich einige Fälle von apikaler Wurzelresorption 25 Jahre lang nicht erholen.71 Angesichts der Eigenschaften seneszierender Zellen, die Apoptose zu umgehen, können die seneszenten Odontoklasten langfristig überleben tragen zur Schwere der Wurzelresorption bei.

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die durch mechanische Belastung induzierten seneszenten Zellen, die durch OTM induziert werden, zur Wurzelresorption beitragen. Allerdings sind weitere detaillierte Untersuchungen unerlässlich, um die Mechanismen zu erforschen, die den Beziehungen zwischen seneszierenden Zellen, der Odontoklastogenese und der Wurzelresorption zugrunde liegen. Beispielsweise besteht eine Diskrepanz zwischen der Anzahl der seneszenten RANKL+-Zellen und der Odontoklasten während der Wurzelresorption (andere Zellen, Moleküle usw. können zur Odontoklastenbildung beitragen). Der langfristige Zusammenhang seneszierender Zellen mit der Wurzelresorption bleibt unklar. Darüber hinaus müssen wir die Ergebnisse bei Menschen und Ratten vorsichtig vergleichen. Andere Bedingungen wie unterschiedliche Verabreichungsintervalle, -dauern und -konzentrationen würden zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Weitere Untersuchungen sind unerlässlich, um zu überprüfen, welche senolytischen Wirkstoffe für den klinischen Einsatz geeignet sind, um Nebenwirkungen zu vermeiden. Wichtig ist, dass unsere Studie zwar die detaillierten molekularen Mechanismen zwischen der RANKL-Expression und der Odontoklastenbildung, die durch zelluläre Seneszenz unter mechanischem Stress induziert wird, mithilfe von In-vitro-Tests nicht aufklären konnte, diese Daten jedoch die Assoziation seneszenter Zellen mit der Odontoklastenbildung verstärken würden. Die Mechanismen sollten im Detail aufgeklärt werden. Unseres Wissens ist dies jedoch die erste Studie, die zeigt, dass durch mechanischen Stress verursachte seneszierende Zementoblasten oder PDL-Zellen eine entscheidende Rolle bei den Wurzelresorptionsmechanismen in vivo spielen; Das in dieser Studie verwendete repräsentative Senolytikum verhinderte Odontoklastogenese und Wurzelresorption. Darüber hinaus wurde die räumlich-zeitliche Verteilung seneszierender Zellen und Odontoklasten in periapikalen Geweben unter der kieferorthopädischen Zahnbewegung offengelegt. Diese Erkenntnisse könnten neue Erkenntnisse für die Entwicklung neuer Präventions- und Behandlungsmethoden für Wurzelresorptionen liefern, die seit Beginn der kieferorthopädischen Behandlung ein langjähriges Anliegen für Ärzte sind.

Zuerst wurde ein 0,014-Zoll-Draht aus rostfreiem Stahl (Ormco Corp. Brea, Kalifornien, USA) mit einer leichten Drahtzange gebogen, wie in Abb. 1a, b gezeigt, die die anfängliche bzw. aktivierte Form verdeutlicht. Das Design basiert auf dem L-Loop-Motiv, das üblicherweise in der klinischen kieferorthopädischen Behandlung verwendet wird. Die spezifischen Designkriterien waren: (1) L-Schlaufen wurden mit einem vertikalen Schritt von 1 mm zwischen der distalen Linie der Schlaufe und der mesialen Linie der Schlaufe in der ursprünglichen Form hergestellt und (2) L-Schlaufen wurden durch aktiviert Drücken Sie die distale Linie auf die gleiche Höhe wie die mesiale Linie. Die vertikale Kraft während der Aktivierung betrug 5 N. Um die Konsistenz der L-Schleife zu bestätigen, wurde eine vertikale Testkraft im aktivierten Zustand für die im Experiment verwendete L-Schleife mit einer universellen Prüfmaschine in der Forschungsabteilung für Biomaterialien von Osaka Dental gemessen Universität. Derselbe Experimentator wiederholte die Messung dreimal, um eine durchschnittliche Testkraft von 5 N als OTM-Modell zu erhalten.

Die örtliche Ethikkommission der Osaka Dental University genehmigte die Tierversuche und die entsprechenden Richtlinien wurden strikt befolgt (Genehmigungsnummer: 22-02031). Für die Versuchsgruppe wurden Sprague-Dawley-Ratten (männlich, 15 Wochen alt) mit einem Gewicht von 400–450 g verwendet, um die Bildung altersbedingter seneszenter Zellen zu vermeiden, die das Experiment beeinträchtigen würden. Alle Ratten wurden von SHIMIZU Laboratory Supplies (Kyoto, Japan) gekauft. Die OTM-Modelle wurden wie in Abb. 1a, b gezeigt angepasst. Nach einer Vollnarkose mit einer Mischung aus drei Anästhetika (Butorphanoltartrat: 2,5 mg·kg-1, Midazolam: 2 mg·kg-1, Medetomidinhydrochlorid: 0,15 mg·kg-1) wurde den Ratten eine L-Schleife angelegt ' links M1 (Abb. 1b). Die Drähte auf den Okklusionsflächen des zweiten und dritten Molaren wurden während der Befestigung vertikal nach unten gedrückt, und Harz (Kuraray Noritake, Nigata, Japan) wurde verwendet, um die Drähte auf dem distalen Teil der Okklusionsflächen M2 und M3 zu befestigen. Anschließend wurde die L-Schleife aktiviert und eine Kraft von 5 N auf die Okklusionsfläche von M1 ausgeübt. Wir verwendeten 32 Ratten, die wie folgt aufgeteilt waren (4 Ratten pro Gruppe; Abb. 1c): 1. Keine Behandlungsgruppe (Kontrolle): nach 14 Tagen eingeschläfert; 2. Versuchsgruppen: an den Tagen 0, 3, 5, 7 und 14 nach der L-Loop-Installation eingeschläfert; 3. 8d+D + Q- und 14d+D + Q-Gruppen: D + Q-Senolytika wurden an den Tagen 1 und 7 nach der L-Loop-Installation verabreicht und am 8. oder 14. Tag eingeschläfert.

Um die Morphologie von OTM und Wurzelresorption zu beobachten, wurden Oberkieferproben von Ratten mittels μ-CT (SkyScan 1275, Bruker Co., Billerica, MA, USA) mit einer Spannung von 85 kV, einem Strom von 65 μA und einer hohen Auflösung gescannt von 1944 × 1546. Die 3D-Daten wurden mit der Software SkyScan™ CT Analyzer (Version 1.17.7.2) und Mimics (Software 13.1 Materialise, Leuven, Belgien) rekonstruiert. Referenzlinien wurden entlang der bukkalen Seite des linken Backenzahns der Ratten an den mesialen und distalen Höckern gezogen (Abb. 1d). Der vertikale Abstand vom mesialen Höcker des M1 zur Referenzlinie wurde als OTM bezeichnet (Abb. 1d). Die Messungen wurden mit ImageJ (Version: 2.1.0, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) durchgeführt. Der mittlere RMD der mesialen Wurzelspitze des linken Oberkiefers M1 wurde ebenfalls quantifiziert.72

Die Proben wurden 24 Stunden lang in 10 % neutralem Formalin fixiert. Nach zweiwöchiger Demineralisierung in neutraler Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Demineralisierungslösung B (Kat.-Nr. LEP2494; Fujifilm Wako Pure Chemicals Corporation) bei 4 °C wurden die Zähne in einem Saccharosegradienten dehydriert. Gefrierschnitte aller Proben wurden mit der Kawamoto-Methode erstellt.73 Serielle Gefrierschnitte mit einer Dicke von 10 µm wurden mit einem Kryotom (Leica CM3050S; Leica Biosystems, Richmond, IL, USA) erhalten. Die HE-Färbung der demineralisierten Schnitte wurde unter Verwendung von Standardverfahren nach einer zuvor beschriebenen Methode durchgeführt.48 Die TRAP-Färbung wurde unter Verwendung des Färbekits (Kat.-Nr. 294-67001; Fujifilm Wako Pure Chemicals Corporation) durchgeführt, um die Odontoklasten und Osteoblasten zu bestätigen. Die Bilder wurden mit einem BZ-9000-Digitalmikroskop (Keyence Corporation, Osaka, Japan) aufgenommen.

Entkalkte Schnitte wurden mit 10 % Antigen-Retrieval-Lösung HistoVT One (Kat.-Nr. 06380-76, Nacalai Tesque. Inc. Kyoto, Japan) antigenrevitalisiert, dann in 5 % Ziegenserum und 0,3 % Triton X-100 in Phosphat blockiert und permeabilisiert -gepufferte Kochsalzlösung. Als nächstes wurden die Schnitte mit primären Antikörpern konjugiert: polyklonaler Anti-p21-Antikörper ALEXA FLUOR® 555 (Kat.-Nr.: bs-10129R-A555, Bioss Antibodies Inc, Woburn, MA, USA, 1:100), polyklonaler Anti-p16-Antikörper ALEXA FLUOR® 594 (Kat.-Nr.: bs-23881R-A594, 1:100), polyklonaler Anti-p16-Antikörper ALEXA FLUOR® 488-Konjugat (Kat.-Nr.: bs-23881R-A488, 1:100), Anti-p16 RANKL ALEXA FLUOR® 647-Konjugat (Kat.-Nr.: bs-20646R-A647, 1:100), Anti-Cathepsin K ALEXA FLUOR® 647-Konjugat (Kat.-Nr.: SC-48353 AF647, Santa Cruz Biotechnology. Inc, Kalifornien , USA, 1:100) und Anti-Zement-Attachment-Protein (3G9) ALEXA FLUOR® 488-Konjugat (Kat.-Nr.: SC-53947 AF488, 1:100), Anti-Ki67 ALEXA FLUOR® 488-Konjugat (Kat.-Nr .: 118825, Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, Massachusetts, USA, 1:100). Die Schnitte wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert und mit DAPI-Fluoromount-G® montiert. Anschließend wurden sie unter einem konfokalen Lasermikroskop (LSM-700, Zeiss-Microscopy, Jena, Deutschland) beobachtet.

Alle oben genannten TUNEL-Färbereagenzien wurden aus den CF™ Dye TUNEL Assay Kits ALEXA FLUOR® 647 (Kat.-Nr. 30074, Fermont, CA, Biotium, Inc.) bezogen. Alle Schnitte wurden gemäß dem Protokoll im Kit gefärbt und mit DAPI-Fluoromount-G® montiert. Alle Schnitte wurden unter einem konfokalen Lasermikroskop (LSM-700, Zeiss-Microscopy, Jena, Deutschland) beobachtet.

Die quantitativen TRAP-, TUNEL-Färbungs- und Immunfluoreszenz-Färbungsanalysen wurden wie folgt berechnet: Der interessierende Bereich (ROI) in jedem Abschnitt wurde unter einem 10-fachen (TRAP-Färbung) oder 20-fachen (TUNEL- und Immunfluoreszenz-Färbung) Sichtfeld analysiert. Anschließend wurde eine Schicht aus Zementzellen auf der Abgrenzungslinie der Wurzelkante als ROI der Wurzeloberfläche pro Abschnitt ausgewählt. Als ROI des PDL-Bereichs wurde der Bereich von der äußeren Zellschicht an der Demarkationslinie bis zur Alveolarknochenoberfläche herangezogen. Wir haben ImageJ (Version: 2.1.0, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) verwendet, um die Anzahl der TRAP-positiven Zellen innerhalb des ROI zu zählen, und Fiji2 (Version: 1.0, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), um die Anzahl der TUNEL-positiven und Immunfluoreszenz-Multiplex-Färbung-positiven Zellen innerhalb des ROI zu zählen. Wir haben vier Proben von vier Ratten (n = 4) getestet. Jede Ratte wurde einem unabhängigen Experiment unterzogen.

Die PEG-200-Lösung wurde durch Auflösen von Polyethylenglykol 200 (PEG-200, Kat.-Nr.: ESL3444, FUJIFILM Wako Pure Chemical Co., Osaka, Japan) in MillQ hergestellt. Dasatinib (Kat.-Nr.: 11498, Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI, USA) und Quercetin (Kat.-Nr.: sc-206089A, SCB Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA) wurden in gelöst Die oben zubereitete PEG-200-Lösung wird zugegeben und gründlich gemischt, um Senolytika herzustellen. Jeder Ratte in der Post-Stress-Gruppe wurden am 1. bzw. 7. Tag nach der L-Loop-Installation 6,67 mg·kg-1 (D) bzw. 66,7 mg·kg-1 (Q) Senolytika oral verabreicht.

Alle Daten wurden statistisch mit Prism 8 (GraphPad Software Co., San Diego, CA, USA) analysiert. Alle Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Für Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurde der Student-t-Test verwendet. Für Vergleiche zwischen fünf Gruppen wurde eine einseitige Varianzanalyse gefolgt vom Tukey-Mehrfachvergleich-Posttest durchgeführt. Ein P-Wert von <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Alle mit dieser Studie verbundenen Daten werden in der Arbeit präsentiert.

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Wir danken Ye Zhang, Yuzhu Sun (Abteilung für Biomaterialien, Osaka Dental University), Jianxin Zhao, Yoshitsugu Nakamoto, Yosuke Miyaji, Hiroshi Matoba (Abteilung für Kieferorthopädie, Osaka Dental University) für die Beratung bei den Tierversuchen und Keita Yoshida (Abteilung für Anästhesiologie). , Osaka Dental University) und Yuya Hirai (Abteilung für Biologie, Osaka Dental University) für ihre Unterstützung bei der Immunfluoreszenzfärbung. Diese Arbeit wurde von JST, CREST Grant Number JPMJCR22L5, Japan, unterstützt.

Abteilung für Kieferorthopädie, Osaka Dental University, 8-1 Kuzuhahanazonocho, Hirakata, Osaka, Japan

Yue Zhou, Aki Nishiura, Hidetoshi Morikuni, Wenqi Deng und Naoyuki Matsumoto

Fachbereich Physik, Osaka Dental University, 8-1 Kuzuhahanazonocho, Hirakata, Osaka, Japan

Toru Tsujibayashi

Abteilung für Anästhesiologie, Osaka Dental University, 8-1 Kuzuhahanazonocho, Hirakata, Osaka, Japan

Yoshihiro Momota

Abteilung für Pharmakologie, Showa University School of Dentistry, 1-5-8 Hatanodai, Shinagawaku, Tokio, Japan

Yuki Azetsu & Masamichi Takami

Abteilung für orale Anatomie, Osaka Dental University, 8-1 Kuzuhahanazonocho, Hirakata, Osaka, Japan

Yoshitomo Honda

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AN, YH und YZ konzipierten und gestalteten die Forschung. YZ, WD und AN führten Experimente durch. YZ, AN, YA, MT und YH analysierten die Daten. YH, YZ und AN haben den Entwurf und das Manuskript geschrieben. HM, TT, YM, YA, MT und NM überarbeitetes Papier. AN und YH überwachten die Forschung. Alle Autoren stimmten der endgültigen Fassung des Papiers zu.

Korrespondenz mit Aki Nishiura oder Yoshitomo Honda.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zhou, Y., Nishiura, A., Morikuni, H. et al. Seneszierende RANKL+-Zellen unter mechanischer Belastung: ein therapeutisches Ziel für die kieferorthopädische Wurzelresorption unter Verwendung von Senolytika. Int J Oral Sci 15, 20 (2023). https://doi.org/10.1038/s41368-023-00228-1

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Eingegangen: 15. Oktober 2022

Überarbeitet: 29. April 2023

Angenommen: 04. Mai 2023

Veröffentlicht: 30. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41368-023-00228-1

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