Antimikrobielle und mechanische Bewertung von Zellulose

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13428 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Kontrolle der Biofilmbildung in der Mundhöhle während kieferorthopädischer Behandlungen ist von entscheidender Bedeutung. Daher sind antimikrobielle Oberflächen für unsichtbare Dentalgeräte sowohl für Therapeuten als auch für Patienten von Interesse. Hier präsentieren wir ein thermoformbares Material auf Zellulosebasis, das für unsichtbare Zahnspangen verwendet wird und mit ätherischen Ölen (EOs) angereichert werden kann, die antibakterielle und antimykotische Eigenschaften haben. Wir gehen davon aus, dass dieses Material EOs absorbieren und freisetzen kann und somit eine antimikrobielle Wirkung hat, ohne die Sicherheit und die mechanischen Eigenschaften zu beeinträchtigen, die für unsichtbare Zahnspangen erforderlich sind. Konventionelle mikrobiologische und isotherme Mikrokalorimetrie-Analysen ergaben, dass das mit ätherischen Ölen beladene thermoformbare Material die Biofilmbildung oraler Streptokokken (S. mutans und S. mitis) unter statischen Bedingungen (p < 0,05) und bei Simulation des Speichelflusses (p < 0,05) deutlich verzögerte. . Darüber hinaus ergaben Zytotoxizitätstests (ISO 10993-5), dass das beladene Material von menschlichen Zahnfleischfibroblasten gut vertragen wird. Schließlich veränderte die Beladung mit antibakteriellen Wirkstoffen die mechanischen Eigenschaften und die Stabilität des Materials nicht wesentlich (Anfangskraft (p = 0,916); Anfangsspannung (p = 0,465)). Im Vergleich zu transparenten Aligner-Materialien des Goldstandards bietet dieses Material eine zuverlässige Kraftübertragung bei kieferorthopädischen Behandlungen. Darüber hinaus weist dieser Ansatz das Potenzial auf, als orale Plattform zur Arzneimittelverabreichung für mehrere Verbindungen zu fungieren.

Mundgesundheit wird oft als selbstverständlich angesehen, Mundentzündungen kommen jedoch weiterhin häufig vor und können zu anderen Krankheiten wie Herzerkrankungen, Diabetes und neurologischen Störungen wie Alzheimer führen1,2. Eine gute Mundgesundheit ist mit einer guten allgemeinen Gesundheit verbunden und könnte sogar mit einem geringeren Risiko für schwere Virusinfektionen wie COVID-193 verbunden sein. Steigende weltweite Ausgaben für Kariesbehandlungen, Zahnfleischentzündungen oder periimplantäre Erkrankungen verursachen enorme finanzielle Belastungen für Haushalte und Versicherungen4. Darüber hinaus kommt der Mundpflege mit der steigenden Zahl kieferorthopädischer Behandlungen eine noch größere Bedeutung zu. Daher steigt in der Mundpflegebranche derzeit das Interesse an antimikrobiellen Oberflächen für Geräte wie kieferorthopädische Brackets, Implantate oder unsichtbare Zahngeräte. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass nach 6 Monaten 10 % der Patienten mit transparenten Alignern und 13,3 % der Patienten mit herausnehmbaren Positionierern aufgrund der Aligner-Besiedlung durch Streptococcus mutans einem Kariesrisiko ausgesetzt waren. Dieser Anteil stieg bei Patienten mit festsitzender Multibracket-Apparatur auf ca. 40 %. Daher wäre antimikrobielles Dentalmaterial für Patienten besonders vorteilhaft5.

Um ein solches antimikrobielles Material zu erhalten, könnten ätherische Öle (EOs) besonders nützlich sein. EOs sind flüssige und flüchtige Substanzen, die aus Pflanzen gewonnen werden. Viele dieser Komponenten interagieren aufgrund ihrer hydrophoben Natur mit der Zellmembran von Bakterien, wodurch die Zelle durchlässiger wird und möglicherweise zum Zelltod führt. Es wurde nachgewiesen, dass EOs antimykotische, antibakterielle, antivirale und insektizide Eigenschaften haben6,7,8,9. Darüber hinaus weisen EOs eine geringe antimikrobielle Resistenz und ein breites Spektrum an antimikrobieller Aktivität auf10,11. Unter den ätherischen Ölen spielt Zimt aufgrund seiner antioxidativen, entzündungshemmenden, antidiabetischen, antimikrobiellen, antitumoralen und lipidsenkenden Eigenschaften eine wichtige Rolle. Das wichtigste bioaktive Molekül im Zimtöl ist Zimtaldehyd, das von der FDA (21 CFR182.6)8 als sicher und ungiftig anerkannt wurde. Im Hinblick auf zahnärztliche Anwendungen hat Zimtaldehyd eine geringe Zytotoxizität gegenüber Fibroblastenzellen gezeigt12, und weder Zimtöl noch Zimtaldehyd gelten als intraorales Allergen, da nur seltene Fälle von allergischer Kontaktdermatitis beschrieben wurden. Daher wird es häufig als Aromastoff für verschiedene Arten von Zahnpasta verwendet, wobei Zimtöl und Zimtaldehyd zusätzlich antimikrobielle Wirkungen gezeigt haben13,14. Zimtaldehyd hat nachweislich keinen Einfluss auf die Kälteschmerzschwelle; Es wurde jedoch nachgewiesen, dass es die mechanische Schmerzschwelle senkt15. Zimtaldehyd und Zimtöle wirken gegen die Frühbesiedler und Karies verursachenden Bakterien S. mutans12,13,16,17,18, Porphyromonas gingivalis19, die parodontale Erkrankungen verursachen, und Candida-Arten, die möglicherweise zu zahnbedingter Stomatitis führen20,21. Darüber hinaus zeigte Zimtextrakt in einer Mundspülung einen Rückgang der Plaque- und Zahnfleischwerte22. Schließlich sind Zimtöle und Zimtaldehyd gut mit anderen antimikrobiellen Mitteln wie Eugenol und organischen Säuren verträglich, was zu additiven oder synergistischen antibakteriellen Wirkungen führt23,24.

Eine aktuelle Studie hat gezeigt, dass es möglich ist, thermoformbare Polymere auf Zellulosebasis, die für unsichtbare Zahnspangen verwendet werden, mit Zimtaldehyd zu beladen25. Die Imprägnierung dieser Polymerverbindungen zeigte eine ausgeprägte antimikrobielle Aktivität des Materials gegen Staphylococcus epidermidis und eine schwächere, aber immer noch signifikante Wirksamkeit gegen orale Streptokokken25. Da unsichtbare Zahnspangen häufig nachts und sogar tagsüber getragen werden müssen und nur minimale Entfernungszeiten für Mahlzeiten und Reinigung erforderlich sind, ist die Verringerung des Risikos der Biofilmbildung und der daraus resultierenden Schädigung der Zahnsubstanz und des Weichgewebes zweifellos eine wertvolle Präventionsstrategie.

Da EO bekanntermaßen synergistische antimikrobielle Wirkungen haben, wenn sie mit Zimtaldehyd verwendet werden, wird erwartet, dass die Möglichkeit, zellulosebasiertes Material mit einer Kombination von EO-Extrakten zu imprägnieren, die Wirksamkeit gegen orale Streptokokken verbessern wird. Daher untersuchte unsere Studie die Wirkung der Beladung unsichtbarer Zahnspangen aus Biopolymeren mit fünf bioaktiven Molekülen aus ätherischen Ölen. Sie wurden auf der Grundlage eines Screenings von 20 ätherischen Ölen auf ihre synergistische antimikrobielle Wirksamkeit gegen orale Streptokokken (S. mutans und S. mitis) ausgewählt. Schließlich wurden die Sicherheit gegenüber menschlichen Zahnfleischfibroblasten und die mechanische Stabilität als Voraussetzung für die Verwendung unsichtbarer Zahnspangen in den oben genannten Anwendungen analysiert. Unsere Studie geht von der Hypothese aus, dass thermoformbare Polymere auf Zellulosebasis EOs absorbieren und freisetzen können und so eine antimikrobielle Wirkung bieten und gleichzeitig die notwendigen Sicherheits- und mechanischen Eigenschaften beibehalten, die mit anderen Zahnspangenmaterialien (wie Zendura) oder anderen Kunststoff-Referenzmaterialien (wie Thermanox) vergleichbar sind.

GCMS-Messungen (Abb. 1A) ermöglichten eine genaue Bestimmung der Menge an bioaktiven Molekülen, die in die Extraktionslösung geladen (Abb. 1B) und anschließend freigesetzt (Abb. 1C) wurden. Die Ladekinetik der absorbierten bioaktiven Moleküle im thermoformbaren Material (NA1.750) folgte einem ungefähr logarithmischen Muster. Im Laufe der Zeit konnte nach 1 Stunde eine Konzentration von 0,544 mg cm−2 bioaktiver Moleküle im NA1.750 geladen werden. Nach dem anfänglichen schnellen Konzentrationsanstieg stieg die Menge an bioaktiven Molekülen nach 6 Stunden weiter bis auf 0,68 mg cm−2 an, jedoch langsamer. Die einzelnen nach 1 Stunde in das Material geladenen Mengen für jede Verbindung wurden wie folgt quantifiziert: Zimtaldehyd 0,254 mg cm–2, Methylsalicylat 0,180 mg cm–2, Transanethol 0,068 mg cm–2, Eukalyptol 0,027 mg cm–2 und Limonen 0,015 mg cm−2, wobei die unterschiedliche Beladungskinetik für die verschiedenen Moleküle betont wird. Bei Zendura, das als vermarktete Referenzprobe verwendet wurde, blieb die Konzentration des bioaktiven Moleküls bei sehr niedrigen Konzentrationen nahe der Basislinie der Auflösungsgrenze (dh 0,05 mg cm−2 nach einer 6-stündigen Belastungsperiode).

(A) Vereinfachte Skizze, die das Messverfahren zur Beurteilung der Beladung von thermoformbarem Material mit EOs sowie der Freisetzungskinetik dieser EOs zeigt, wenn das Material in 40 %ige Ethanollösung gegeben wird (siehe Details im Abschnitt „Materialien und Methoden“). (B) Ladekinetik: Jeder Punkt stellt die Summe aller einzelnen EO-Konzentrationen dar, die nach einer bestimmten Ladeperiode absorbiert werden (blaue Raute: NA1.750, rote Kreuze: Zendura). C) Freisetzungskinetik: Jeder Punkt stellt die Summe aller einzelnen ätherischen Ölkonzentrationen dar, die nach einem bestimmten Freisetzungszeitraum freigesetzt werden (blaue Raute: NA1.750, rote Kreuze: Zendura).

Die Messung der Molekülfreisetzung aus dem thermoformbaren Material NA1.750 und Zendura, das 1 Stunde lang belastet wurde, zeigte einen exponentiellen Rückgang über die Zeit. Nach einer Extraktion von 12 Stunden nahm die Konzentration der Moleküle in Richtung der Auflösungsgrenze ab (Abb. 1C). Insbesondere bei Zendura-Material trat dieser Rückgang bereits nach einem Zeitraum von 1 Stunde auf. Die Zusammenfassung aller einzelkomponentenbezogenen Konzentrationen finden Sie im Zusatzmaterial (Ergänzungstabellen S2 und S3).

Die in einer Pflegelösung gelösten ausgewählten bioaktiven Moleküle werden für einen Zeitraum von 1 Stunde in die verschiedenen thermoformbaren Polymermaterialien (NA1.750 und Zendura) geladen. Die antimikrobielle Wirkung der beladenen Materialien wurde unter Verwendung eines festen Mediums in Kombination mit isothermer Mikrokalorimetrie bewertet und mit unbeladenen Kontrollmaterialien verglichen, die gleichzeitig in PBS gegeben wurden (Abb. 2A).

(A) Vereinfachte Skizze, die das experimentelle Verfahren zur Bewertung der antimikrobiellen Aktivität beladener thermoformbarer Materialien (NA1.750 (blau) und Zendura (rot) als Kontrolle) unter Verwendung isothermer Mikrokalorimetrie zur Messung des Biofilmwachstums und der Stoffwechselwärme zeigt (siehe Details im Haupttext). ) unter statischen Bedingungen. (B) Wachstum von S. mutans (oben) und S. mitis (unten) Biofilmen auf NA1.750-Material, beladen mit der Pflegelösung (beide hellblau), die EOs enthält, oder mit PBS als Kontrolle. Beachten Sie die Wachstumsverzögerung in beiden Fällen. (C) Verzögerungsphasendauer (d. h. Wachstumsverzögerung) von Biofilmen, berechnet mit dem Gompertz-Wachstumsmodell und ausgedrückt in Stunden für die verschiedenen Materialien, die mit EOs oder PBS als Kontrolle beladen sind. (D) Durchflusszellenaufbau zur Beurteilung der Entwicklung unter konstantem Flüssigkeitsfluss. (E) Menge an Biofilm, die sich innerhalb von 16 Stunden auf Thermofolien-Materialscheiben in der Durchflusszelle gebildet hat (siehe D), quantifiziert mit dem Kristallviolett-Assay. In C und E stellen die vertikalen Balken die Standardabweichung dar, Unterschiede zwischen Gruppen werden durch den p-Wert angezeigt; NS weist auf keine signifikanten Unterschiede hin.

Bei Verwendung von beladenem NA1.750-Material wurde das Wachstum sowohl von S. mutans als auch von S. mitis deutlich verzögert (Abb. 2B). Eine solche Verzögerung wurde mithilfe von Wachstumsmodellen in Tabelle 1 eindeutig quantifiziert, wobei die Verzögerungsphase (dh die Zeit bis zum exponentiellen Wachstum) einen Anstieg von etwa 22 Stunden für S. mutans und 35 Stunden für S. mitis zeigte (Abb. 2B). Nach dieser anfänglichen Wachstumsverzögerung bleiben die beobachteten Wachstumsraten ähnlich wie bei unbelastetem NA1.750 (Tabelle 1). Im Gegensatz dazu hatte eine Beladung des Referenzmaterials Zendura mit der Pflegelösung keinen Einfluss auf die Biofilmbildung, da im Vergleich zu unbeladenen PBS-Proben keine Verzögerung des Bakterienwachstums beobachtet wurde (Abb. 2C). Dies korreliert mit den Ergebnissen der GCMS-Messungen und zeigt, dass Zendura nur geringe Absorptionsfähigkeiten für die bioaktiven Moleküle zeigte, die für die Verzögerung des Bakterienwachstums relevant sind (Abb. 1).

Die kariesbedingte Biofilmbildung bei S. mutans unter Bedingungen, die den mit dem Speichelfluss in der Mundhöhle vergleichbaren Scherstress nachahmen, wurde durch Flusskammerexperimente bewertet (Abb. 2D, E). Das beladene NA1.750-Material zeigte die geringste Biofilmbildung auf seiner Oberfläche. Unbeladenes NA1.750-Material war anfälliger für die Kolonisierung mit Biofilmen und zeigte einen Anstieg von 78 % im Vergleich zu seinem beladenen Gegenstück (d. h. 100 % Referenz) (p < 0,001, n = 96). Dies unterstreicht, dass die Behandlung mit Pflegelösung, die bioaktive Moleküle enthält, dem NA1.750-Material wirksam antimikrobielle Eigenschaften verleiht. Beladenes Zendura-Material zeigte nach 16 Stunden die höchste Menge an Oberflächenbiofilmbildung mit einem Anstieg von 127 % im Vergleich zu beladenem NA1.750-Material (p < 0,001, n = 96). Auch dieses Ergebnis korreliert mit den GCMS-Daten und den damit verbundenen geringen Absorptionsfähigkeiten bioaktiver Moleküle, die für das Zendura-Material gefunden wurden. Mikroskopische Beobachtungen an beladenem und unbeladenem NA1.750 bestätigten auch die Verringerung der Biofilmbildung für S. mutans und S. mitis (siehe ergänzende Abbildungen S4 und S5).

Um die biologische Sicherheit des beladenen Polymermaterials sicherzustellen, wurden Zytotoxizitätstests durchgeführt. Hierzu wurden die oben beschriebenen thermoformbaren Polymere 1 Stunde lang geladen und kurz gespült und ihre zytotoxische Reaktion auf menschliche Gingivafibroblastenzellen (HGF-1) gemäß ISO 10993-5 untersucht (Einzelheiten siehe Abschnitt „Materialien und Methoden“). Als Basismaterial wurde Thermanox (TX – Polystyrol) verwendet, das für seine gute Biokompatibilität bekannt ist. Unbeladene thermoformbare Materialien zeigten eine hohe Lebensfähigkeit der Zellen. Das NA1.750-Material hatte eine relative Zelllebensfähigkeit von 115 %, verglichen mit dem Zendura-Material mit einer relativen Zelllebensfähigkeit von 168 % (Abb. 3A). Bei der Durchführung des Assays mit beladenem NA1.750-Material verringerten die aus dem Material extrahierten bioaktiven Moleküle die Lebensfähigkeit von HGF-1 bei einer indirekten Exposition von 24 Stunden auf 58 %.

(A) relative Zelllebensfähigkeit und Zytotoxizität der Thermofolienmaterialien (gemessen gemäß der Norm ISO 10993-5). Als Kontrolle wurde Thermanox (TX) verwendet und die Werte wurden auf TX normiert. (B) Entwicklung der Zytotoxizität des beladenen NA1.750-Materials mit zunehmender Spülzeit. Als Kontrolle wurde Thermanox (TX) verwendet und die Werte wurden auf TX normiert. (C) Entwicklung der antimikrobiellen Wirksamkeit des beladenen NA1.750-Materials mit zunehmender Spülzeit. Zu Vergleichszwecken wurde Zendura hinzugefügt. In (A, B und C) stellen die vertikalen Balken die Standardabweichung dar. * weisen auf signifikante Unterschiede zwischen unbeladenem Material und TX hin.

Um die Speichelspülung und die damit verbundene Extraktion von antimikrobiellen Mitteln in der Mundhöhle zu simulieren, wurde das mit NA1.750 beladene Material vor der Zytotoxizitätsbewertung über einen längeren Zeitraum mit Wasser gespült. Mit zunehmender Spülzeit nahm die Zytotoxizität ab (Abb. 3B). Im Vergleich zur Thermanox-Basislinie zeigten ungespülte NA1.750-Proben eine Lebensfähigkeit von 49 ± 13 %, während 5 Minuten lang gespülte Proben bereits eine Lebensfähigkeit von 58 ± 12 % aufwiesen (p = 0,005, n = 54). Nach 30 Minuten und 60 Minuten stieg die Lebensfähigkeit auf 68 ± 12 % (p < 0,001, n = 54) bzw. 72 ± 15 % (p < 0,001, n = 54). Diese relative Lebensfähigkeit der Zellen stieg nach 1 Stunde nicht wesentlich an und blieb bei 75 ± 13 % (p = 0,26, n = 54).

Da sich gezeigt hat, dass das Spülen die bioaktiven Moleküle aus dem mit NA1.750 beladenen Material freisetzt, war eine verringerte antimikrobielle Aktivität zu erwarten. Daher wurden ähnliche Spülexperimente durchgeführt, um die verbleibende antibakterielle Wirksamkeit gegen S. mutans nach dem Spülen des beladenen NA1.750-Polymers zu bewerten. Eine deutlich längere Lag-Phase von 39 ± 7 h wird auch nach 1 min Spülung beobachtet (p = 0,007, n = 6). Bei längerer Spülzeit verringerte sich die Verzögerungsphase mit zunehmender Spülzeit auf den Ausgangswert (Abb. 3C). Nach 3-stündigem Spülen wurden keine Unterschiede in der Verzögerungsphase im Vergleich zu unbeladenen Materialien beobachtet (Abb. 3C) (p = 0,45 und p = 0,37 für 3 bzw. 6 Stunden). Wie bei der vorherigen Messung zeigte die Wachstumsrate keine signifikanten Veränderungen (p = 0,61, n = 18).

Die 3-Punkt-Biegetests (siehe Abb. 4A) charakterisieren die mechanischen Eigenschaften und die zeitabhängige Stabilität der thermogeformten und belasteten Polymere (Zendura; sowie beladenes und unbelastetes NA1.550, NA1.750) basierend auf der Spannungsrelaxationserkennung über Zeit (siehe Beispiel in Abb. 4B). Die mittleren Maximalkräfte (Anfangskraft) und die mittleren Maximalspannungen (Anfangsspannung) mit ihrer entsprechenden Standardabweichung sind in Abb. 4C,D dargestellt. Obwohl kleine Abweichungen beobachtet wurden, hatte die Belastungszeit keinen signifikanten Einfluss auf die Anfangskraft (p = 0,916, n = 25) oder die Anfangsspannung (p = 0,465, n = 26). NA1.750- und NA1.750-Material, das 1 Stunde lang mit bioaktiven Molekülen beladen wurde, zeigen ähnliche Anfangsspannungen mit 35,35 ± 2,38 MPa und 36,28 ± 2,29 MPa und ähnliche Anfangskräfte mit 6,1 ± 0,8 N bzw. 5,9 ± 0,7 N. Eine 6-stündige Belastung des NA1.750 führte zu einer verringerten Anfangsspannung von 33,12 ± 3,77 MPa und einer Anfangskraft von 5,4 ± 0,8 N, vergleichbar mit der von Zendura mit einer Anfangsspannung von 32,06 ± 0,38 MPa und einer Kraft von 5,8 ± 0,1 N. Die deutlich niedrigeren anfänglichen Kraft- und Spannungswerte des NA1.550-Materials, belastet und unbelastet, sind auf die geringere Materialdicke im Vergleich zu NA1.750 und Zendura zurückzuführen (p < 0,001, n = 25 und p < 0,001, n = 26). Die Spannungsverhältnisse der getesteten Proben sind in Abb. 4E dargestellt. Das Verhältnis wurde berechnet, indem die Anfangsspannung und die Spannung nach 8-stündiger, 12-stündiger und 24-stündiger Biegung dividiert wurden. Zendura zeigte die niedrigsten Verhältniswerte und damit die niedrigste Spannungsrelaxation von 1,28 ± 0,02 und 1,35 ± 0,02 nach einem Zeitraum von 8 Stunden und 24 Stunden. NA1.750 zeigte Spannungsverhältnisse von 1,44 ± 0,32 bis 1,66 ± 0,44 für 8 bis 24 Stunden Spannungsrelaxation. Schließlich hatte die Beladung mit bioaktiven Molekülen bei einer einstündigen Belastung keinen signifikanten Einfluss auf die mechanische Stabilität des NA1.750-Materials und zeigte nach 24 h eine etwas geringere Spannungsrelaxation von 1,60 ± 0,03. Bei einer Belastungszeit von 6 Stunden stiegen die gesamten Spannungsrelaxationsverhältnisse von NA1.750 im Vergleich zum unbelasteten Materialsystem nach 24 Stunden auf 2,14 ± 0,08. Dieser starke Verlust der mechanischen Stabilität bei einer Belastungszeit von 6 Stunden gilt nicht für NA1.550.

(A) Schema eines 3-Punkt-Biegeaufbaus mit den in Gl. beschriebenen Parametern. (2–3). (B) Beispiel einer Spannungsrelaxationsmessung von thermoplastischen Materialien unter statischen Biegebedingungen für 24 Stunden. (C) Gemessene anfängliche (maximale) Spannungen und (D) gemessene anfängliche (maximale) Kräfte des gebogenen Thermofolienmaterials nach 24-stündigem statischen Biegen unter nassen Bedingungen. (E) Diese Abbildung zeigt das Spannungsverhältnis der getesteten Proben nach 8 h, 12 h und 24 h. Das Verhältnis wurde berechnet, indem die Anfangsspannung und die Spannung nach 8-stündiger, 12-stündiger und 24-stündiger Biegung dividiert wurden. In (C, D und E) stellen die vertikalen Balken die Standardabweichung dar.

Somit führt die Beladung mit bioaktiven Molekülen durch Einweichen in Pflegelösung bei einer einstündigen Belastung nicht zu einem signifikanten Anstieg der Spannungsverhältnisse und scheint daher keinen deutlich negativen Einfluss auf die mechanische Stabilität des NA1.750 und NA1.550 zu haben Materialien mit der beabsichtigten Verwendung als transparente Aligner.

Die Absorption und Freisetzung von EOs durch das thermoformbare Material auf Zellulosebasis führte zu einer antimikrobiellen Wirkung gegen S. mutans und S. mitis, die durch die Beladung des Materials mit einer Kombination von 5 aus EOs extrahierten bioaktiven Verbindungen erreicht wurde. Darüber hinaus behielt das Material seine mechanischen Eigenschaften und blieb gegenüber menschlichen Zahnfleischfibroblasten sicher. Die antimikrobielle Wirkung kann bei Goldstandard-Polymeren auf PETg- oder TPU-Basis (z. B. Zendura) nicht beobachtet werden, da bioaktive Wirkstoffe nicht mit ätherischen Ölen beladen werden können (nur ein winziger Bruchteil könnte an ihrer Oberfläche haften).

Die nachgewiesene antimikrobielle Wirkung dieser Studie lässt sich gut mit vielversprechenden In-vivo-Studien vergleichen, die mit einzelnen bioaktiven Molekülen oder EOs durchgeführt wurden, aus denen diese Moleküle gereinigt wurden. Es hat sich beispielsweise gezeigt, dass die mit Zimt-EO erzielte Reduzierung des Plaque- und Zahnfleischindex mit der Reduzierung mit Chlorhexidingluconat (0,2 %) vergleichbar ist22. Tatsächlich ist der Hauptbestandteil von Zimt-EO, der 51 bis 84 % ausmacht, Zimtaldehyd26,27, der auch in der hier untersuchten Lösung vorhanden ist. Es wurde auch gezeigt, dass Zimtaldehyd die Ansäuerung von S. mutans-Biofilmen hemmt, was zu ungünstigeren Bedingungen für die Bakterien und damit zu einer verringerten Biofilmbildung führt; In Kombination mit der Wirkung, die Zimtaldehyd auf die Zelloberfläche von S. mutans hat, indem es seine Hydrophobie erhöht, was zu einer verringerten Fähigkeit zur Co-Aggregation führt, spielt dieses EO eine wichtige Rolle bei der allgemeinen Hemmung und Reduzierung der kariogenen Biofilmbildung28.

Andere EOs wie Eukalyptol (1,8-Cineol) und Limonen, die häufig mit Zimtaldehyd in natürlichen Extrakten assoziiert sind19,26,27, sind ebenfalls Teil der Zusammensetzung der Lösung, die zum Beladen des NA1.750-Materials verwendet wird. Eukalyptol (1,8-Cineol) hat sowohl antimikrobielle als auch antibiofilmische Eigenschaften gegen S. mutans gezeigt29; Während gezeigt wurde, dass Limonen möglicherweise die Säureresistenz von S. mutans und die Biofilmbildung auf Sub-MIC-Ebene hemmt, ohne unbedingt das Wachstum der Bakterien zu beeinträchtigen30. Darüber hinaus zeigen ähnliche Studien, dass solche bioaktiven Moleküle oder EOs einen umfassenderen Einfluss auf die Mundgesundheit haben können, indem sie das Wachstum von Krankheitserregern, die für Gingivitis und Parodontitis verantwortlich sind, wie Porphyromonas gingivalis19, hemmen oder die durch Aggregatibacter actinomycetemcomitans31 verursachte Entzündung begrenzen.

In Gegenwart von 5 natürlichen antimikrobiellen Wirkstoffen hemmte das thermoformbare Material auf Zellulosebasis das Wachstum von Streptokokken-Biofilm auf der Oberfläche und verzögerte den Wachstumsbeginn im Vergleich zu unbeladenem Material unter statischen Bedingungen um 22 Stunden. Darüber hinaus ist die Biofilmbildung während solcher Zeitintervalle auch unter reinem Stress, vergleichbar mit Speichelflussbedingungen, stark verringert (bei t = 16 h). Solche Hemmungsperioden sind länger als die typischen Tragezeiten unsichtbarer Zahnspangen zwischen zwei Reinigungs- oder möglichen Belastungsereignissen (ca. 8 Stunden). Daher ist bei einer Zahnspange aus diesem Material bei entsprechender Anwendung und Belastung mit einer geringeren Biofilmbildung zu rechnen, was wiederum zu einem geringeren Risiko für Plaquebildung und Karies führt.

Hinsichtlich der Verwendung im Rahmen der Mundpflege wurde die Zytotoxizität des Materials gemäß europäischen Richtlinien als akzeptabel angesehen. Tatsächlich wurde bei der Testmethode eine 24-stündige Extraktion in einem relativ kleinen Volumen (0,5 ml) verwendet, was ein Worst-Case-Szenario darstellen würde. Allerdings ist der Aligner in der Mundhöhle einem ständigen Speichelfluss ausgesetzt (0,5 bis 1,5 l Tag−1)32. Unter der Annahme, dass die Extraktionsvolumina angepasst würden, würden die EO-Konzentrationen wiederum um das Tausendfache reduziert (bei minimaler Speichelproduktion). Die langsame Freisetzungskinetik bioaktiver Moleküle ermöglicht den Einsatz der Anwendung bei niedrigen Konzentrationen, die um Größenordnungen von den von der Europäischen Chemikalienagentur (https://echa.europa.eu/) festgelegten Nahrungsaufnahmegrenzen der einzelnen Verbindungen entfernt sind. Daher wird das umliegende Gewebe nicht negativ beeinflusst. Bezüglich des potenziellen „Cocktail“-Effekts der verschiedenen bioaktiven Moleküle, die in der Beladungslösung und schließlich im imprägnierten Material vorhanden sind, muss beachtet werden, dass viele dieser Verbindungen häufig zusammen in EOs vorkommen (z. B. in Zimt-EO und Wintergrün-EO19). ,26,27,33). Die Tatsache, dass einige EO-Extrakte nachweislich eine stärkere antimikrobielle Wirkung haben als ihre isolierten Bestandteile, legt nahe, dass es zumindest einige additive Effekte und/oder Synergien zwischen diesen Bestandteilen gibt, die weiter untersucht werden sollten8,34. Die präsentierten Ergebnisse sind vielversprechend und sollten in prospektiven In-vivo-Studien reproduziert werden. Tatsächlich stimmen die Konzentrationen in beladenen unsichtbaren Zahnspangenmaterialien mit Studien an murinen Parodontitismodellen überein, die zeigen, dass die orale Aufnahme von Zimtaldehyd in einer Konzentration von 8 bis 16 mg kg−1 Tag−1 die Mikrobiota-Dysbiose und die Entzündungsreaktion des Wirts deutlich verringert und gleichzeitig die osteogene Wirkung fördert Induktionseffekte. Darüber hinaus wird in derselben Studie betont, dass die orale Aufnahme von Zimtaldehyd für die Tiere unbedenklich blieb35. Dies qualifiziert möglicherweise unsichtbare Zahnspangen, die mit bioaktiven Molekülen beladen sind, als entzündungshemmende Zahnspangen für die vorbeugende Mundpflege.

Bezüglich der mechanischen Eigenschaften der unsichtbaren Zahnspangen ist anzumerken, dass die Belastung beider thermoformbarer Materialien auf Zellulosebasis (NA1.750 und NA1.550) zu keiner wesentlichen Verschlechterung der mechanischen Stabilität führte. Dabei simuliert eine konstante Auslenkung der Polymere die Wechselwirkung zwischen der unsichtbaren Zahnspange und den Zähnen im Laufe der Zeit. Die festgestellten Anfangskräfte des Naturaligner-Materialsystems im Bereich von 2 bis 7 N sind vergleichbar mit den In-vitro-Ergebnissen von thermoplastischen Goldstandardmaterialien, die in Clear-Aligner-Therapien eingesetzt werden36,37. Darüber hinaus können beide mit antimikrobiellen Wirkstoffen beladenen Materialien auf Zellulosebasis vergleichbare Anfangskräfte zur anfänglichen Bewegung der Zähne im Rahmen von Clear-Aligner-Therapien bereitstellen, die mit Goldstandard-Materialien wie Zendura vergleichbar sind. Die mechanische Belastungsstabilität (Stressresistenz) qualifiziert, wie Kräfte im Laufe der Zeit während einer Clear-Aligner-Therapie auf die Zähne übertragen werden38. Die Belastungsbeständigkeit der geladenen Naturaligner-Materialien ist vergleichbar mit dem Entspannungsverhalten von Goldstandard-Materialien wie Duran, Zendura und anderen ähnlichen Materialien39 und liefern daher im Laufe der Zeit ausreichend Kräfte, um z. B. laterale und Distalisationsbewegungen während Clear-Aligner-Therapien umzuwandeln40.

Abschließend müssen wir die Stärken und Schwächen der Studie hervorheben. Oder die Studie liefert eine ziemlich vollständige Reihe von Experimenten, die ein umfassenderes Bild des Potenzials unsichtbarer Zahnspangen mit antimikrobieller Beschichtung, aber auch potenzieller Möglichkeiten zur Arzneimittelabgabe in die Mundhöhle liefern. Die Grenzen unserer Studie liegen jedoch in der Anzahl der untersuchten Stämme. Tatsächlich wird die Mundhöhle von mehr als 700 Arten bewohnt41,42 und unsere Modelle umfassen nur zwei davon, die derselben Gattung angehören. Darüber hinaus sollten Studien verschiedene Mikroben umfassen, um unsere Beobachtungen zu erweitern. Ein interessanter Kandidat könnte zu Actinomyces oris und verwandten Arten gehören, die frühe Besiedler sind, die für Gingivitis verantwortlich sind und kürzlich als wichtiger Akteur bei Parodontitis erkannt wurden43,44,45. Es ist zu beachten, dass der aktuelle Aufbau das Arbeiten unter anaeroben Bedingungen und höheren CO2-Konzentrationen, die üblicherweise in der Mundhöhle auftreten, nicht vollständig zulässt. Dies beschränkt diese Studie derzeit auf Stämme, die Sauerstoff gut vertragen und keinen höheren pCO2 benötigen. Für weitere Untersuchungen parodontaler Krankheitserreger werden jedoch solche Bedingungen erforderlich sein. Darüber hinaus wirkten sich teilweise technische Einschränkungen (z. B. Anzahl der Messkanäle) auf die Anzahl der untersuchten Proben aus. Die begrenzte Anzahl an Wiederholungen ist eindeutig eine Einschränkung dieser Studie. Um diese Einschränkung weiter zu untersuchen, wurde eine retrospektive Leistungsanalyse durchgeführt. Es zeigte sich, dass die statistische Analyse angesichts des großen beobachteten Effekts ausreichend aussagekräftig war (Leistung > 0,82 für die Kalorimetrie und Leistung > 0,99 für alle anderen Analysen). Obwohl unsere Ergebnisse vielversprechend sind, sprechen sie sich größtenteils für mehr Forschung und insbesondere für weitere Tierstudien oder klinische Studien mit zusätzlichen In-vitro-Untersuchungen an einem breiteren Spektrum von aus der Mundhöhle isolierten Mikroben bei einem breiteren Spektrum von Erkrankungen aus. Insbesondere den Erregern von Zahnfleischentzündungen und Parodontitis sollte mehr Aufmerksamkeit geschenkt werden. Schließlich könnten auch aus Speichel extrahierte Entzündungsmarker wie MMP-8/9 wertvoll sein.

Im Gegensatz zu hochkonzentriertem Mundwasser oder anderen flüssigen Desinfektionsmitteln wie Chlorhexidin ermöglicht die kontinuierliche und gezielte Freisetzung antimikrobieller Wirkstoffe aus Zahnspangen auf Zellulosebasis in Richtung Zähne und Weichgewebe die Verwendung körperverträglicher und nicht zytotoxischer Dosen, die dennoch einen signifikanten Antibiofilm erzielen Wirksamkeit. Derzeit wird eine solche antimikrobielle Wirkung bei thermoformbaren Zahnspangenmaterialien mit den vorgestellten Naturstoffen nur durch die Kombination mit zellulosebasiertem Naturaligner-Material erreicht. Die geladenen Materialien zeigten stabile mechanische Eigenschaften, die es ihnen ermöglichten, ihren traditionellen Verwendungszweck als transparente Aligner, Nachtschienen oder Retainer zu erfüllen. In diesem Zusammenhang stellt die Integration antimikrobieller ätherischer Öle in individuelle unsichtbare Zahnspangen einen effizienten Ansatz zur vorbeugenden Zahnpflege durch kieferorthopädische Behandlungen dar. Insgesamt bietet das hier vorgestellte beladene thermoformbare Material auf Zellulosebasis zusätzlich zu seiner antimikrobiellen Wirkung eine wertvolle Plattform für die personalisierte Medikamentenabgabe direkt an die Zahnoberfläche und das Zahnfleisch.

Es wurde das mehrschichtige thermoformbare Material auf Zellulosebasis (Naturaligner; Bottmedical; Schweiz) mit einer Dicke von 750 μm (NA1.750) und 550 μm (NA1.550) verwendet. Diese thermogeformten Folien (40 s und 35 s bei 220 °C in Biostar, Scheu Dental, Deutschland erhitzt) wurden in Scheiben mit einem Durchmesser von 10 mm geschnitten, um in den anschließenden antimikrobiellen Testexperimenten verwendet zu werden. Zendura FLX (Bay Materials; Fremont; CA; USA) wurde bei 50 s thermogeformt, in Scheiben mit einem Durchmesser von 10 mm geschnitten und als Referenzmaterial getestet. Die thermogeformten Materialien wurden mit bioaktiven Molekülen ätherischer Öle imprägniert, indem Scheiben (nicht mehr als fünf Scheiben) eine Stunde lang unter leichtem Schütteln (15 Umdrehungen pro Minute auf einem Rollenschüttler) in 10 ml einer Lösung gelegt wurden, die die Mischung aus vier bioaktiven Molekülen enthielt. . Die wasserbasierte Lösung mit ätherischen Ölen und bioaktiven Molekülen enthielt Zimtaldehyd, Methylsalicylat, Eukalyptol, Limonen und Transanethol in einem Verhältnis von 1/20 zum Polyglycerol-4-Laurat/Sebacat-Lösungsvermittler in Wasser (Pflegelösung). Ein kurzes Spülen (ca. 5 s) in PBS und anschließendes Trocknen auf sterilisiertem Papiertuch wurde durchgeführt, um ungebundene ätherische Öle zu entfernen. Alle Chemikalien wurden von Sigma Aldrich (Buch; Schweiz) bezogen.

Die Aufnahme und Freisetzung der fünf bioaktiven Moleküle der Pflegelösung durch das thermoformbare Material NA1.750 wurde mittels GCMS gemessen. Ein Agilent GCMS-System (Santa Clara; CA; USA) unter Verwendung einer HP-5MS UI-Kapillarsäule (30 m × 0,250 mm, 0,25 µm Dicke, Agilent Technologies; Santa Clara; CA; USA). Die anfängliche Ofentemperatur betrug 2,25 Minuten lang 75 °C, und die Temperatur wurde mit einer Geschwindigkeit von 15 °C pro Minute auf 300 °C erhöht und 3 Minuten lang auf dieser Temperatur gehalten. Als Trägergas wurde Helium mit einer Flussrate von 1,0 mL min−1 verwendet. Das Injektionsvolumen betrug 1 µL bei einem Aufteilungsverhältnis von 20:1. Die Injektortemperatur betrug 300 °C, die Transferleitungstemperatur betrug 320 °C und die Temperatur der MS-Quelle betrug 240 °C. Die Elektronenstoßionisation (EI) wurde bei 70 eV durchgeführt. Die Detektion wurde im ausgewählten Ionenüberwachungsmodus (SIM) durchgeführt. Der Molekülionenpeak wurde zur Quantifizierung verwendet, mit Ausnahme von Triacetin (145,1 m/z) und Carvacrol (135,1 m/z). Das Instrument wurde mit der MassHunter GC/MS Acquisition Software (B07.06.2704) betrieben. Die Verarbeitung, Interpretation und Quantifizierung der gemessenen Daten erfolgte mit MassHunter Quantitative Analysis (Agilent Technologies; Santa Clara; CA; USA – Version B.09.00/Build 9.0.647.0).

Die Kalibrierung erfolgte mit trans-Zimtaldehyd (≥ 95 %), (+)-Carvon (≥ 98 %), trans-Anethol (99 %), (R)-(+)-Limonen (97 %), Eukalyptol (99 %). ), Methylsalicylat (≥ 99 %), Carvacrol (99 %) und Triacetin (99 %), bezogen von Sigma Aldrich (Buch; Schweiz) und HPLC-Ethanol von Fisher Scientific (Reinach; Schweiz). Die Stammlösung enthielt eine Mischung aller Standardproben in einer Einzelkonzentration von 588 µg mL−1 (Limonen) bis 826 µg mL−1 (Methylsalicylat) in Ethanol. Eine weitere Verdünnung mit Ethanol ergab die Arbeitslösungen, die zur Bewertung der Linearität der Detektorreaktion und zur Zuordnung einer Kalibrierungskurve zu jeder der interessierenden Verbindungen verwendet wurden. Kalibrierungskurven: D-Limonen: 4 Punkte (0,37–18 µg mL−1, R2 = 0,9987); Eukalyptol: 4 Punkte (0,41–20 µg mL−1, R2 = 0,9998); Methylsalicylat: 5 Punkte: (0,52–50 µg mL−1, R2 = 0,986); Carvon: 4 Punkte (0,40–19 µg mL−1, R2 = 0,9975); Zimtaldehyd: 5 Punkte (0,46–44 µg mL−1, R2 = 0,9778); trans-Anethol: 4 Punkte (0,43–21 µg mL−1, R2 = 0,9910), Carvacrol: 5 Punkte (6,9–172 µg mL−1, R2 = 0,9972); Triacetin: 4 Punkte (0,51–24 µg mL−1, R2 = 0,9926). Die ermittelte Genauigkeit lag typischerweise zwischen 80 und 120 % für Konzentrationen über 5 µg mL−1 und nahm bei Konzentrationen unter 1 µg mL−1 deutlich ab.

Nachdem 3 cm2 der thermogeformten Polymerproben in 5 ml Pflegelösung geladen wurden, wurden die Proben kurz in Wasser gespült und ihr Gehalt an bioaktiven Molekülen bis zu 24 Stunden lang in 5 ml 40 %igem Ethanol extrahiert. Bioaktive Moleküle wurden auf einem Schüttler (Typ 44/44, Exakt) mit 100 Umdrehungen·min−1 extrahiert. Aufgrund der hohen Probenanzahl, die für die Zeitreihe (Beladung und Freigabe) benötigt wird, wurde nur 1 Probencharge analysiert. Wir gehen jedoch davon aus, dass die größere genutzte Fläche mögliche Schwankungen ausgleicht. Darüber hinaus ist die Genauigkeit der Messung oben beschrieben und für eine solche Untersuchung akzeptabel.

Für die isothermen Kalorimetrieexperimente und die Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität von beladenem Polymermaterial wurden Streptococcus mutans (ATCC 25175) und Streptococcus mitis (ATCC 49456) als Vertreter des oralen Mikrobioms verwendet (LGCpromochem; Wesel; Deutschland). Diese beiden Streptokokken gelten als potenzielle Frühbesiedler für unsichtbare Zahnspangen, die bis zu 12 Stunden (also etwa über Nacht) getragen werden. Vor der Verwendung wurden über Nacht Streptokokkenkulturen in einer Gehirn-Herz-Infusion (BHI – Sigma Aldrich; Buchs; Schweiz) unter Verwendung eines gefrorenen Aliquots als Inokulum hergestellt. Ein Teil des Aliquots wurde auf BHI-Agar ausplattiert, um die Reinheit des im Aliquot vorhandenen Stamms sicherzustellen. Bei Bedarf wurde die Dichte der Kultur durch geeignete Ausplattierungsverdünnung auf agarisiertem BHI (aBHI – Agar und BHI von Sigma Aldrich; Buchs; Schweiz) gemessen.

Für die kalorimetrische Messung wurden 10 µL der Vorkultur auf eine beladene thermoformbare Materialscheibe gegeben. Die beimpfte Seite der Scheiben wurde gegenüber festem BHI platziert, das in kalorimetrischen 20-ml-Fläschchen zubereitet wurde. Auf die Rückseite der Scheibe wurde leichter Druck ausgeübt, bis sich die Flüssigkeit gleichmäßig auf der Oberfläche zwischen Scheibe und Agar verteilt hatte. Die Fläschchen wurden verschlossen und in ein Kalorimeter (TAM III und TAM Air; Waters/TA Instruments; Delaware; USA) gegeben. Nach dem Einsetzen der Fläschchen in das Kalorimeter und einem Zeitraum von 1 Stunde zur thermischen Äquilibrierung wurde der Wärmefluss aufgezeichnet, bis das Signal zur Grundlinie zurückkehrte oder mindestens 96 Stunden lang. Negativkontrollen wurden mit Scheiben hergestellt, die 1 Stunde lang PBS ausgesetzt wurden. Ebenso wurde die Sterilität während der Messungen überprüft, indem eine unbeladene und nicht beimpfte Scheibe verwendet wurde, die das gleiche Verfahren durchlief. Alle kalorimetrischen Messungen wurden dreifach unter Verwendung steriler Reagenzien und Materialien mit aseptischen Techniken durchgeführt.

Am Ende des Experiments wurden Daten gesammelt und mit dem TAM-Assistenten (Waters/TA Instruments; Delaware; USA) in eine ASCII-Datei umgewandelt. Die Rohwärmeflusskurven wurden integriert, um Gesamtwärmekurven im Zeitverlauf zu erhalten, die einer Wachstumskurve ähneln. Diese Daten wurden dann unter Verwendung des modifizierten Gompertz-Modells angepasst, das von Zwietering et al.46 neu geordnet wurde (Gleichung 1) und auf die Verwendung der folgenden Parameter beschränkt: μmax die maximale Wachstumsrate, λ die Dauer der Verzögerungsphase, Qt die erzeugte Wärme Zeit t und Qmax die maximale Wärme. Alle Berechnungen wurden mit R und dem Grofit-Paket47,48 durchgeführt.

Um kalorimetrische Ergebnisse in einem System mit Flüssigkeitsströmung zu bestätigen (um eine mit dem Speichelfluss in der Mundhöhle vergleichbare Scherspannung nachzuahmen), wurden Strömungskammern (Minucells; Bad Abbach; Deutschland) verwendet (Abb. 2D).

Eine Kolonie von Streptococcus mutans (ATCC 25175), die auf einer Columbia-Blutagarplatte (Columbia-Agar; BBL; Becton Dickinson; Basel; Schweiz) gewachsen war, wurde in 25 ml Todd-Hewitt-Medium (BBL; Becton Dickinson; Basel; Schweiz), ergänzt mit 0,5, inokuliert % Saccharose (Sigma Aldrich; Buchs; Schweiz) und aerob bei 37 °C für 22 Stunden inkubiert. S. mutans-Zellen wurden in der stationären Wachstumsphase geerntet, mit physiologischer Kochsalzlösung (Sigma Aldrich, Buchs, Schweiz) gewaschen und in simulierter Körperflüssigkeit (SBF) (7,996 g NaCl, 0,35 g NaHCO3, 0,224 g KCl, 0,228 g K2HPO4) resuspendiert ·3H2O, 0,305 g MgCl2·6H2O, 0,278 g CaCl2, 0,071 g Na2SO4, 6,057 g (CH2OH)3CNH2 gelöst in 1 l hochreinem Wasser, pH-Wert eingestellt auf 7,25 mit 1 mol L−1 HCl, alle Chemikalien von Sigma Aldrich (Buchs; Schweiz)49. Scheiben aus thermoformbarem Material (NA1.750), die zuvor mit der Pflegelösung beladen wurden, sowie dieselbe Scheibe ohne Beladung mit Pflegelösung und Zendura FLX (Bay Materials; Fremont; CA; USA) wurden mit gepooltem Speichel beschichtet (Anonym gesammelter Speichel wurde gepoolt und durch 70-µm-Filter filtriert, 40 Minuten lang bei 4 °C und 22.000 g zentrifugiert; der Überstand wurde gesammelt und durch Anwenden zweier aufeinanderfolgender Filter von 0,45 und 0,22 µm filtersterilisiert) vor jedem Experiment für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Zirkulierende Bakterien (ungefähr 2·108 KBE mL−1) durften 16 Stunden lang bei 37 °C in einem aeroben Strömungskammersystem, das ein Bakterienreservoir und eine Strömungskammer mit einer Gruppe von Bakterien enthielt, an den proteinbeschichteten Materialien haften Die Proben wurden auf einen Schüttler gestellt (180 U/min, um die Lösung homogen zu halten), eine peristaltische Pumpe wurde mit 0,8 ml pro Minute betrieben, um eine mit dem Speichelfluss in der Mundhöhle vergleichbare Scherspannung nachzuahmen, und eine Abfallsammelflasche für gebrauchte Bakteriensuspension wurde verwendet. Jede Durchflusskammer bot Platz für 24 Proben und alle Gruppen wurden zweimal getestet, was zu n = 48 für alle drei Probengruppen führte.

Danach wurden die Scheiben vorsichtig aus der Durchflusskammer entnommen, vorsichtig in physiologische Kochsalzlösung getaucht und in Platten mit 24 Vertiefungen luftgetrocknet. Die getrockneten Biofilme wurden 10 Minuten lang im Dunkeln mit 0,5 %iger Kristallviolettlösung gefärbt und anschließend wurde der überschüssige Farbstoff durch Eintauchen der Proben in 3 l Reinstwasser entfernt, um jeglichen ungebundenen Farbstoff zu entfernen. Nach dem Trocknen an der Luft wurden die Proben mit absolutem Ethanol entfärbt und die Absorption bei 595 nm mit einem Spektrophotometer (BioTek Synergy 2, BioTek Instruments AG, Luzern, Schweiz) gemessen. Als Blindmessung wurde absolutes Ethanol verwendet. Die Experimente wurden mit sterilen Reagenzien und Materialien unter Verwendung aseptischer Techniken durchgeführt.

Um sicherzustellen, dass die beladenen Polymermaterialien keine zytotoxische Wirkung auf Zellen im Zahnfleisch haben, wurde die Lebensfähigkeit der Zellen von menschlichen Zahnfleischfibroblasten (HGF-1) bewertet. HGF-1 (ATTC American Type Culture Collection (LGCpromochem; Wesel; Deutschland)) wurde in Zellkulturmedium in einem Inkubator (CB 220; Binder) bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Das Medium bestand aus Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM High Glucose; Sigma-Aldrich; Buchs; Schweiz) mit 1 ml Penicillin-Streptomycin (Sigma-Aldrich; Buchs; Schweiz), 1 ml Natriumpyruvat (Gibco; Thermo Fisher Scientific; Reinach). ; Schweiz), 1 ml L-Glutamin (Gibco), 1 % Amphotericin B-Lösung (Sigma-Aldrich; Buchs; Schweiz) und 10 ml fötales Kälberserum (FCS superior; Bioswisstech; Schaffhausen; Schweiz) pro 100 ml hinzugefügt. Für die Experimente wurden die Passagen 4 bis 9 menschlicher gingivaler Fibroblastenzellen (HFG-1) verwendet. Bevor die vollständige Konfluenz erreicht wurde, wurden die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS – Sigma-Aldrich; Buchs; Schweiz) gespült, dann wurden 1,5 ml 5 % Trypsin/2 % Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung zugegeben, um die Zellen abzulösen . Die Experimente wurden mit einem indirekten Ansatz gemäß ISO-Standard 10.993–5 (Anhang C, D) durchgeführt. Polystyrolscheiben (Thermanox Plastic Coverclips; Nalgene Nunc International; Rochester; NY; USA) dienten als Negativkontrolle und 90 % Ethanol als Positivkontrolle. Thermoformbare Materialscheiben mit einem Durchmesser von 12 mm wurden wie oben beschrieben vorbereitet und geladen und bis zur Verwendung unter sterilen Bedingungen in 24-Well-Platten gelagert.

Scheiben aus thermoformbarem Material (NA1.750) wurden 24 Stunden lang bei 37 °C in 500 µL Vollmedium in 24-Well-Platten inkubiert. In der Zwischenzeit wurden 104 Zellen pro Vertiefung auf Platten mit 24 Vertiefungen ausgesät und 24 Stunden lang inkubiert. Nach 24 h wurde das Zellkulturmedium entfernt, die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, das Medium der inkubierten Proben zugegeben und die Zellen weitere 24 h inkubiert. Für beide Versuchsaufbauten wurden insgesamt 9 Proben pro Gruppe getestet.

Anschließend wurde ein WST-1-Zelllebensfähigkeitstest (Cell Proliferation Reagent WST-1; F. Hoffmann-La Roche; Basel; Schweiz) durchgeführt. Daher wurde das Zellmedium abgesaugt und 500 µL WST-1-Lösung gemischt mit Zellmedium (1:10) in jede Vertiefung gegeben. Anschließend wurden die Proben weitere 2 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden 3 × 100 µL WST-1-Lösung pro Well in eine 96-Well-Platte überführt und die optische Dichte wurde bei einer Wellenlänge von gemessen (RT-2100C Microplate Reader; Rayto Life and Analytical Sciences; Shenzhen; China). 420 nm. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung der Ergebnisse von Thermanox (TX – Polystyrol) als Referenzmaterial, das für seine gute Biokompatibilität bekannt ist, normalisiert, um die relative Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Die Experimente wurden mit sterilen Reagenzien und Materialien unter Verwendung aseptischer Techniken durchgeführt.

Da beim Spülen des beladenen thermoformbaren Materials (NA1.750) bioaktive Verbindungen aus der zellulosebasierten Schicht freigesetzt werden, wurde die Auswirkung des Spülens auf die Zytotoxizität sowie auf die antimikrobielle Wirksamkeit unter Verwendung der gleichen Methoden wie oben beschrieben (d. h. isotherme Mikrokalorimetrie und) bewertet WST-1-Assay). Das Laden des thermoformbaren Materials erfolgte durch Einlegen von Scheiben des thermoformbaren Materials in die Pflegelösung (5 Scheiben für 10 ml Lösung) und Inkubieren dieser Scheiben unter langsamem Rühren (15 Umdrehungen pro Minute) für 1 Stunde. Das Spülen erfolgte unter den gleichen Bedingungen mit PBS (zur isothermen Mikrokalorimetrie) oder 0,9 %iger NaCl-Lösung (zur Bestimmung der Zytotoxizität). Es wurden unterschiedliche Spülzeiten im Bereich von 1 Minute bis 6 Stunden gewählt. Pro Spülzeit wurden insgesamt 9 Proben geprüft. Die Experimente wurden mit sterilen Reagenzien und Materialien unter Verwendung aseptischer Techniken durchgeführt.

Um sicherzustellen, dass die Beladung mit bioaktiven Molekülen der ätherischen Öle die mechanischen Eigenschaften des thermoformbaren Materials nicht negativ beeinflusst, wurden mechanische Tests wie folgt durchgeführt. Entspannungstests wurden auf einer elektromechanischen Universalprüfmaschine (FMT-313 Alluris; Freiburg im Breisgau; Deutschland) durchgeführt, die mit einem Lastsensor (50 N) ausgestattet war, der die Kraftbelastung zeitaufgelöst aufzeichnete. Die Proben wurden zunächst aus thermogeformten NA1.750-, NA1.550- und Zendura-Materialien (Bay Materials; Fremont; CA; USA) mit einem Laserschneidverfahren (40-W-CW-CO2-Laser; Glowforge; Seattle; WA; USA) lasergeschnitten vier Proben mit einer Größe von jeweils 40 × 15 mm.

Der 3-Punkt-Biegeversuch wurde durchgeführt, um ihre statischen Eigenschaften zu messen, z. B. maximale Kraft (Anfangskraft) und maximale Spannung (Anfangsspannung) sowie ihre Spannungsrelaxation über einen Belastungszeitraum von 24 Stunden50. Die Spannweite wurde auf 22 mm eingestellt. Aufgrund der unterschiedlichen Materialstärke der Proben nach dem Thermoformen wurde die vertikale Auslenkung der Biegespitze auf 2 mm eingestellt, um eine innere Dehnung von 1,6 % zu erreichen49. Die Dicke jeder Probe wurde nach dem Thermoformen mit einer Mikrometerschraube an drei verschiedenen Stellen gemessen und der Mittelwert berechnet. Die Kraft (N) wurde 24 Stunden lang alle 59 Sekunden aufgezeichnet.

Die Relaxationsspannung wird aus Gl. berechnet. (2–3). Es wird das Spannungsverhältnis zwischen der Ausgangsspannung und der reduzierten Spannung nach 8, 12 und 24 Stunden Entspannungszeit bestimmt.

Und

σ ist die technische Spannung (MPa) und ε ist die technische Dehnung. In diesen Gleichungen ist L die Stützspannlänge = 22 mm, F die Kraft (N), B die Probenbreite (15 mm) und h die Probendicke (mm).

Thermogeformte Polymerproben wurden entweder in Wasser (Zendura – Bay Materials; Fremont; CA; USA) oder in die antibakterielle Pflegelösung gelegt, um den Einfluss der beladenen antimikrobiellen Substanzen auf die mechanische Stabilität des Materials zu bewerten. Alle mechanischen Testbewertungen wurden mindestens dreifach durchgeführt.

Für die deskriptive Analyse und den Vergleich zwischen den in den vorherigen Abschnitten berechneten Parametern wurden Daten in einer Tabellenkalkulationssoftware gesammelt. Die Normalität der Ergebnisse wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test für eine kleine Stichprobengröße getestet. Der Student-T-Test oder der Wilcoxon-Test wurden gegebenenfalls angewendet, um statistisch signifikante Unterschiede zwischen den beladenen und unbeladenen Materialgruppen zu ermitteln. Nachdem die Verteilungsannahmen (Normalität und vergleichbare Varianzen) überprüft wurden, wurde eine zweifaktorielle ANOVA verwendet, um die Bedeutung der Dicke und der Belastungszeit für die mechanischen Parameter des Materials zu bewerten. Das Signifikanzniveau wurde auf p < 0,05 festgelegt. Alle Daten wurden mit R (Version 3.6.3)47 verarbeitet. Alle im Text angezeigten Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt.

Daten können direkt bei den Autoren oder durch Kontaktaufnahme mit dem entsprechenden Autor angefordert werden.

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Die Autoren danken INNOSUISSE (Schweizerische Agentur für Innovation) für die Finanzierung durch den Zuschuss 51907.1.IP-LS und die Vorfinanzierung, die zu diesem Projekt geführt hat (Innocheck 44118.1 INNO-LS). Die Autoren danken auch Nadia Bahlouli und dem Icube-Team („laboratoire des sciences de l'ingénieur, de l'informatique et de l'imagerie“ (UMR7357)) der Universität Straßburg für die mechanischen Tests. Drei anonyme Gutachter lieferten Kommentare und Bearbeitungen, die wesentlich zur Verbesserung des Originalmanuskripts beitrugen. Außerdem werden einige ihrer Vorschläge und Kommentare für zukünftige Forschungen übernommen.

Abteilung Forschung, Universitätszentrum für Zahnmedizin Basel UZB, Universität Basel, Mattenstrasse 40, Basel, Schweiz

Monika Astasov-Frauenhoffer, Livia Göldi & Nadja Rohr

Department of Biomedical Engineering (DBE), Zentrum für Biomechanik und Biokalorimetrie, Universität Basel, Allschwil, Schweiz

Sarah Worreth und Olivier Braissant

Bottmedical AG Technologiepark Basel, Hochbergerstrasse 60C, 4057, Basel, Schweiz

Elise Dard, Selina Hünerfauth & Tino Töpper

Departement Chemie, Universität Basel, Mattenstrasse 24a, Basel, Schweiz

Jonas Zurflüh

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OB, MAF, NR und TT haben die Studie entworfen; MAF, LG, NR, SW, ED, SH, TT, JZ, OB führten die Messungen durch und trugen zur Datenanalyse bei; OB, MAF, NR und TT haben das Originalmanuskript geschrieben; Alle Autoren haben das Manuskript vor der Einreichung kritisch geprüft.

Korrespondenz mit Olivier Braissant.

Tino Töpper, Elise Dard und Selina Hünerfauth sind bei der Bottmedical AG angestellt. Monika Astasov-Frauenhoffer Livia Göldi, Nadja Rohr, Sarrah Worreth, Jonas Zurflüh, Olivier Braissant haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Astasov-Frauenhoffer, M., Göldi, L., Rohr, N. et al. Antimikrobielle und mechanische Bewertung von thermoformbarem Material auf Zellulosebasis für unsichtbare Zahnspangen mit natürlichen ätherischen Ölen zum Schutz vor Biofilmbildung. Sci Rep 13, 13428 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39320-1

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Eingegangen: 17. November 2022

Angenommen: 23. Juli 2023

Veröffentlicht: 18. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39320-1

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